[发明专利]一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法

摘要

一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNaseI活性的方法，属于分子生物学中的酶学技术领域。本发明工艺步骤为：（一）检测探针的制备：包括：（1）15nm粒径金纳米粒子AuNP1合成，（2）25nm粒径金纳米粒子AuNP2合成，（3）AuNP1和DNA1偶联，（4）AuNP2分别和DNA2、DNA3、DNA4偶联，（5）AuNP1与AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构；（二）圆二光谱CD检测，建立CD信号强度与DNaseI活性之间的标准曲线。本发明提供了一种基于圆二光谱来检测DNaseI活性的方法，与传统的检测手段相比，具有灵敏度高、检测限低、方便、快捷的优点，有着非常好的实际应用前景。

主权项

一种基于金四面体手性纳米结构检测核酸内切酶DNase I活性的方法，其特征在于工艺步骤为：（一）检测探针的制备（1）15nm粒径金纳米粒子AuNP1合成采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成15nm粒径金纳米粒子AuNP1；（2）25nm粒径金纳米粒子AuNP2合成采用柠檬酸三钠还原氯金酸合成25nm粒径金纳米粒子AuNP2；（3）AuNP1和DNA1偶联步骤（1）合成出的AuNP1和巯基修饰的DNA1进行偶联形成AuNP1‑DNA1复合体：取50mL 2nM的步骤（1）制备的AuNP1加入20mg二水合双（对‑璜酰苯基）苯基膦化二钾盐，震荡混匀，孵育12h后离心去除上清液，将沉淀以10 mL 0.5×TBE重悬；向其中加入DNA1，控制DNA1与AuNP1的摩尔比为5:1，2h后，加入2M氯化钠使得氯化钠终浓度为50mM，12h后，离心，去除游离的DNA1分子，得到AuNP1‑DNA1复合体；DNA1：HS‑5’‑TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC‑3’；（4）AuNP2分别和DNA2、DNA3、DNA4偶联步骤（2）合成出的AuNP2和巯基修饰的DNA2、DNA3、DNA4分别进行偶联形成AuNP2‑DNA2、AuNP2‑DNA3、AuNP2‑DNA4复合体，偶联步骤与步骤（3）相同；DNA2：HS‑5’‑TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG‑3’；DNA3：HS‑5’‑TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC‑3’；DNA4：HS‑5’‑TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC‑3’；（5）AuNP1与AuNP2组装形成具有手性的金四面体结构分别取步骤（4）制备出的1mL 2nM的AuNP2‑DNA2、AuNP2‑DNA3、AuNP2‑DNA4复合体和步骤（3）制备出的1mL 2nM的AuNP1‑DNA1复合体混匀进行杂交，杂交缓冲液：1×TBE，杂交时间24h，形成具有手性的金四面体结构；对该金四面体结构进行透射电镜表征与圆二光谱表征；（二）圆二光谱CD检测，建立CD信号强度与DNase I活性之间的标准曲线向步骤（5）制备的手性金四面体溶液1mL, 2nM中加入一系列不同活性浓度的DNase I：分别为0U/mL、0.005U/mL、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1 U/mL、0.2 U/mL、0.5 U/mL、1U/mL、10 U/mL；37℃下反应10 min后，测定CD信号，以DNase I活性为横坐标，CD信号强度为纵坐标，建立标准曲线。