[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法

摘要

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌核酸检测方法。所述方法为：根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计特异性的引物序列，提取待测样品的DNA为模板，进行LAMP反应；对LAMP结果进行分析，若LAMP扩增结果为阳性，则待测样品含有鼠伤寒沙门氏菌。本发明提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。

主权项

一种鼠伤寒沙门氏菌的核酸检测方法，其特征在于，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术体系扩增靶基因的特定区域，其具体步骤为：(1).根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的环介导等温扩增引物；(2).提取待检测样品DNA及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因组DNA或其它鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA、或含检测靶序列的重组质粒DNA；(3).鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测的反应体系组成如下：2xU‑LAMP反应混合液10μl，其组成为：40mM Tris‑HCl、pH8.8、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、10mM MgSO4、0.2％Triton X‑100、2.4mM dNTPs、1.6M甜菜碱；10x引物混合液1μl，其组成为：F3为2μM，B3为2μM，BIP为12μM，FIP为12μM，LF为3μM，LB为3μM，；模板DNA1μl、Bst聚合酶0.75μl、补水至20μl，同时设置阴阳性对照扩增体系，阴阳性对照扩增体系除模板外，其余成分同上述检测反应体系；(4).特定的程序为：64.0℃45min→80℃5min→‑20℃保存；(5).LAMP反应结束LAMP反应结果进行的分析及判定的方法包括：①肉眼直接观察反应浊度②琼脂糖凝胶电泳分析③肉眼观察反应液颜色的变化.所述述3种方法中可选一种或多种作为判断标准，其中：①肉眼直接观察反应管内溶液的浊度变化：在核酸的合成过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，且随反应的进行沉淀量加大，在反应结束后，可直接通过肉眼判读，反应液出现浑浊沉淀，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；②琼脂糖凝胶电泳分析：取LAMP扩增产物5μl，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下出现典型的梯状条带，则说明该管扩增反应为阳性；反之，则为阴性；③加入1/1000的Sybrgreen I染料观察反应液颜色变化或者紫外照射下检测荧光：如果含有扩增产物，反应混合液为绿色，否则保持Sybrgreen I的橙色不变；在紫外照射的条件下，能够检测到荧光则为阳性；反之，则为阴性。