[发明专利]一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法

摘要

本发明公开了一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，它涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域。它的具体操作步骤如下：(1)制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液；(2)制备新鲜菌丝体；(3)酶解菌丝细胞壁：(4)原生质体分离；(5)原生质体再生。本发明易于操作，对设备要求低，同时酶解时间及再生周期短，有效提高了原生质体制备及再生的效率。

主权项

一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，具体操作步骤如下： (1)、制备芦笋茎枯病菌分生孢子悬液： 挑取芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi菌丝一环，接种在由50mL燕麦琼脂培养基制成的固体斜面上，在温度25℃、光照12h／d条件下培养10‑14d，待出现成熟的芦笋茎枯病菌分生孢子器(可分泌出分生孢子)后，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团块的孢子液，用移液器将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液进行倍比稀释，显微镜下计数，得到浓度为1×106个／mL的芦笋茎枯病菌分生孢子悬液； (2)、制备新鲜菌丝体： 将制备好的分生孢子悬液接种于液体完全培养基中，25℃条件下150r／min摇床培养72h，漏斗过滤，获得新鲜菌丝体； (3)、酶解菌丝细胞壁： 取1.0g新鲜菌丝体，加入10mL裂解酶、崩溃酶和蜗牛酶的混合酶液，33℃水浴酶解4.5h，采用1.0mol／L MgSO4(10m mol／L pH6.98的PBS配制，体积比为MgSO4：PBS=3∶1)做渗透压稳定剂时，原生质体数量达到2.8×107个／mL； (4)、原生质体分离： 过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度4℃、转速5000r／min、离心分离5min；弃上清液，用1‑2mL浓度1.0mo1／L的山梨醇溶液洗涤2‑3次，收集原生质体重悬于1mL浓度1.0mol／L预冷的山梨醇溶液中保存，得到原生质体悬液； (5)、原生质体再生： 将原生质体悬液用浓度0.6mol／L的蔗糖溶液稀释100倍，取稀释液0.1mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板和高渗马铃薯葡萄糖琼脂平板；温度25℃、保持相对湿度60％‑75％、光照培养12h／d，培养3‑5d直至长出直径约1mm再生菌落；调查再生情况，对形成的菌落记数(A)；以 不含稳渗剂的PDA培养基作对照(B)。计算再生率，再生率(％)=(A‑B)×100／总原生质体数。