[发明专利]黄瓜花粉半薄切片MTG-DAPI双染色观察线粒体DNA

摘要

本发明是对黄瓜花粉的树脂半薄切片进行MTG(Mito Tracker Green)和DAPI双荧光染色观察的方法，涉及植物组织固定、植物花药Technovit7100树脂半薄切片以及MTG-DAPI双荧光染色，属于生物技术领域。本发明首次观察到黄瓜贴壁期花粉生殖细胞内的线粒体及其包含的DNA，可以用于探索黄瓜花粉发育过程中线粒体数目的变化规律，同时为进一步研究黄瓜线粒体父系遗传的相关机制做基础。该方法也可以应用于其他植物材料中线粒体的观察，用以确定植物材料是否具有线粒体基因组父系遗传或双亲遗传的潜力。

主权项

黄瓜花粉半薄切片MTG‑DAPI双染色观察线粒体DNA的方法，包含下列步骤： （1）Technovit7100树脂包埋样品的制备： 1)花朵采集：采集新鲜的大小不同的黄瓜花朵，收集于湿润的吸水纸中； 2)醋酸杨红染色液的配置：将1克洋红溶于100毫升冰醋酸后，将溶液与一小块锈铁加热至沸腾即可； 3)固定液的配置：溶液包括2.5％的戊二醛，0.1M磷酸缓冲液(pH=7.2)； 4)用醋酸洋红染色确认花粉的发育时期：在载玻片上滴20微升醋酸洋红溶液，用镊子将花粉从花药中挤入醋酸洋红溶液中，并将盖玻片盖于其上，于酒精灯上加热烤片(注意不要沸腾)，然后将染色过的载片于显微镜下观察，用以判断花粉的发育时期，贴壁期花粉的特点为，花粉中有一个营养核，一个生殖核，其中生殖核紧贴花粉细胞壁并形成自己的细胞膜，营养核的染色相对生殖核要浅，细胞质中散布多个小液泡，选取贴壁期的花蕾，用镊子将花药转移至固定液中，抽真空后置于4℃冰箱，固定12小时以上； 5)清洗固定液：用镊子将固定液中的花蕾取出放置于载玻片上，取下花药并转移至1.5毫升EP管中(注意尽量去除非花药结构的杂质)，用移液枪吸弃固定液，加入1毫升0.1M PBS缓冲液对花药进行清洗，每次20分钟，共清洗4次，最后用蒸馏水清洗一遍，时间20分钟； 6)样品梯度脱水：吸弃蒸馏水用酒精进行梯度脱水，15％的酒精对样品脱水30分钟，30％的酒精1小时，50％的酒精过夜，70％的酒精1小时，对不同花粉发育时期的样品，每个挑选5个左右于1.5ml EP管中用85％的酒精脱水1小时(剩余的样品于70％的酒精中保存于‑20℃冰箱)，90％的酒精1小时，95％的酒精1小时，每30分钟更换一次，100％酒精(无水硫酸铜处理过)2小时，中间更换两次溶液，为防止脱水过度纯酒精中放置不得超过3小时； 7)预渗透液和渗透液的配置：从此步开始所用仪器一定要充分干燥，在玻璃试管中配置预渗透液和渗透液，预渗透液的组成为Basic Liquid：无水乙醇=1：1，渗透液由100毫升的Basic Liquid与1克的Hardener I构成，4℃可保存4周，为了防止制样硬度不够，此步配置渗透液时可适当增加Hardener I的用量； 8)预渗透：脱水后的花药置于预渗透液中室温静置3小时，预渗透时间不宜过长，控制在6小时以内； 9)渗透：将材料转入渗透液中常温下渗透过夜； 10)新鲜配置包埋液：每500微升渗透液加33微升Hardener II，快速轻轻混匀，需现配现用，为了防止制样硬度不够，此步配置包埋液时可适当增加HardenerII的用量； 11)包埋：将新鲜配置的包埋液，加入至21孔包埋板的胶囊孔中，每孔加300微升；用镊子将渗透好的样品加入样品孔，调整样品方向和位置(室温操作控制在5分钟以内)，立即转入45℃恒温箱中固化5‑7天(常温下3小时固化，恒温箱中前两天不可以移动样品)，室温较高时，室温下的操作时间也要相应的减少； 12)样品保存：包埋好的样品块置于吸水纸中包好，放在纸袋里常温保存，温度较低时样品硬度会降低，所以保存的样品进行切片时，要提前3‑5天放置于45℃恒温箱中进行固化； (2)MTG‑DAPI双染色样品的制片和观察： 1)切片：聚合好的样品块经过修理后进行半薄切片，用Leica Ultracut R型超薄切片机切片，切片厚度为400纳米，Technovit7100树脂偏软，解决的方法一是减小修快面积<1cm²，二是增加切片厚度，增大厚度可能造成染色效果变差所以尽量不用，切片中可能存在的问题有切片卷曲、切片成碎末、包埋块质黏切片切不下来、切片时花粉粒的识别困难，针对这些问题需要注意，修块时尽量将切面修小防止卷曲，切成粉末一般是因为沾了水，而且是不可逆的，不要用手直接摸包埋块，尽量保持包埋块干燥，同时，脱水不可过度，可在50％乙醇中停留或过夜后再进行进一步脱水，并且在纯酒精中脱水不可过久，样品块需要在恒温箱中放置5天以上，充分硬化后再进行切片操作，在制样过程中渗透液、预渗透液和聚合液的配置应能尽可能的保持干燥，脱水到95％乙醇的时候可以加入固绿染液对花药壁进行染色，方便修快和确定花粉位置； 2)烤片：将切片用细玻璃管转移至滴有去离子水的干净载玻片上，60℃烤干固定(每个载玻片可放4片)； 3)配置DAPI染色液：将粉末溶于Tan buffer中配制成浓度为100mg／ml的储存液。使用时，用Tan buffer将储液稀释至0.1μg／ml，Tan buffer的组成为：20mM的Tris·HCl，0.5mM的EDTA，1.2mM的亚精胺，7mM的β‑巯基乙醇(使用前加入)； 4)配置MTG染色液：将Mitotracker Green FM^TM(Molecular Probes)溶于DMSO溶液中配成1mM的储存液，使用时用无水乙醇将储液稀释至20nM； 5)切片脱树脂：镊子夹住附着有切片的载玻片于装有100％酒精(无水硫酸铜处理)的EP管中浸润7分钟，进行脱树脂处理； 6)MTG染色：将切片转移至浓度为20nM的MTG工作液中静置染色30分钟； 7)MTG清洗：将切片置于摇床上，在50％的酒精中清洗3分钟，再于蒸馏水中清洗3分钟，最后用滤纸吸走多余的水分； 8)DAPI染色：滴加浓度为0.1μg/ml的DAPI溶液染色6分钟(黑暗下)，染色完成后的 切片用吸水纸吸取染液，即可用于荧光显微镜的观察； 9)荧光观察：先在蓝光(WIB)下观察MTG染色结果，再在紫外光(WU)下观察DAPI染色图像； (3)照片处理：MTG‑DAPI双染色切片用荧光显微镜获取图像，为了能够比较清晰的观察到线粒体DNA，我们采用了黑白色的图像采集模式，并进行反向处理。