[发明专利]一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

摘要

本发明涉及一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以短须裂腹鱼心脏组织为材料，采用组织块法和两酶消化法，在含有胎牛血清和细胞生长因子，pH值为7.0-7.2 的M199培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、操作简便；2、降低了纯组织块法对心脏细胞的损伤；3、构建的短须裂腹鱼心脏细胞系形态为成纤维样，生长状态良好，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；4、该构建方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。

主权项

一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其特征在于该方法的步骤如下：（1） 制备PBS消毒液和细胞培养液PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；基础培养液：向M199培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%；原代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为150IU/ml，链霉素浓度为150µg/ml，两性霉素B浓度为20 µg/ml；传代培养液：向M199培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100µg/ml，两性霉素B浓度为10 µg/ml； 调节上述培养液的pH值为7.0‑7.2，放置于4℃冰箱中保存备用；（2） 原代培养以75%的酒精消毒1龄健康短须裂腹鱼鱼体，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其心脏，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗心脏组织3次后，用无菌器械剪成组织小块，然后用2ml 0.2%胰蛋白酶‑EDTA消化6 min，用0.2ml胎牛血清中和胰酶反应，1000rpm离心收集心脏组织块，再在心脏组织块中加入2ml 0.1%Ⅳ型胶原酶消化1h，1200rpm离心收集心脏组织块及细胞，原代培养液重悬，并将其接种于25 cm2细胞培养瓶中，于18℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，以除去未贴壁的组织和死细胞；（3） 传代培养原代心脏细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶‑EDTA溶液1 ml，消化1 min，细胞变圆后，加入传代培养液1 ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2进行传代，于18 ℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第5代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功；（4） 细胞冻存与复苏（a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括M199培养液，胎牛血清和DMSO，按5:4.5:0.5的体积比混合，现用现配；（b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200 rpm离心6 min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存保护液，重悬，使细胞的浓度为1×106个/ml，将1 ml细胞悬液转移至1.8 ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，‑80℃过夜，然后放入液氮中长期保存；（c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15 ml离心管中，并加入等量基础培养液，1200 rpm离心6 min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18 ℃培养箱中培养，5天细胞即长成单层。（5）各步骤中所用百分比均为体积百分比。