[发明专利]一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，将EGF—TCSKDEL基因亚克隆至Bac-to-Bac系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，用抽提的质粒DNA转染家蚕细胞BmN，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒，用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，获得大量表达EGF—TCSKDEL融合蛋白；本发明具有较高的表达量和生物活性，为创造新的高活性、高抑瘤率、低免疫原性、小分子量的靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。

主权项

一种用家蚕杆状病毒Bac‑to‑Bac系统表达EGF—TCSKDEL融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将EGF—TCSKDEL基因从质粒pET28a‑EGF—TCSKDEL中亚克隆至Bac‑to‑Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游；（2）将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素和半乳糖苷类似物X‑Gal的培养板上过夜培养；（3）通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组；（4）用此DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有EGF—TCSKDEL基因的重组杆状病毒；（5）利用Ni－NTA柱从感染重组杆状病毒的家蚕细胞中分离纯化重组EGF—TCSKDEL融合蛋白：用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞有感染迹象时，收集细胞，将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用Ni－NTA柱分离纯化获得相应的目的蛋白质，并通过SDS‑PAGE分析纯化的蛋白纯度。