[发明专利]一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法

摘要

本发明涉及一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱与高分辨质谱联用检测方法，它利用离子对反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素部分降解产物的各个组分，通过离子对反相色谱分离样品中各组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，计算出各组分的糖链序列信息，包括两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，从而对各低分子肝素部分降解产物的结构进行比较精细的表征。本发明可以检测低分子肝素部分降解产物的两端结构、糖链长度、乙酰基及硫酸基取代数量，解决了现有技术中仅能获得低分子肝素部分降解的紫外吸收图谱的问题，对于提高肝素的检测水平、保障药品安全具有极大的实用价值。

主权项

一种低分子肝素部分降解产物的离子对反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：（1）将胺类离子对试剂溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相A，并将pH调至5.5～8.5；或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于去离子水，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相A’；（2）将胺类离子对试剂溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%的甲醇溶液中，制得胺类离子对浓度为10～40mM的流动相B，并将pH调至5.5～8.5；或者，将胺类离子对试剂及六氟异丙醇溶解于体积百分比为75%的乙腈或体积百分比为75%甲醇溶液，制得胺类离子对浓度为10～40mM、六氟异丙醇浓度为20～100mM的流动相B’；（3）将待测低分子肝素样品溶于流动相A或流动相A’，配制成浓度为6～10mg/mL的待测溶液，经过滤后，使用C18反相色谱柱；流速8～12μL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，95%流动相A，5%流动相B；5～60min，65～95%流动相A，5～35%流动相B，或者，0～5min，95%流动相A’，5%流动相B’；5～60min，60～95%流动相A’，5～40%流动相B’；（4）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；（5）通过紫外检测色谱图确定低分子肝素的种类，然后根据步骤（4）获得的高分辨质谱图获得主要峰的质荷比M，经如下公式计算组分的精确分子量m：正离子模式：m=zM‑nX‑zY负离子模式：m=zM‑nX+zY其中：z表示电荷数，n表示离子对试剂分子个数，X表示离子对试剂的分子量，Y表示质子氢的分子量；（6）使用计算机辅助方法进行解谱，具体过程为：通过计算机生成各肝素组分的分子量数据库，用步骤（5）中得到的精确分子量与数据库中的理论分子量进行比对获得误差值Ⅰ，按误差值Ⅰ的大小对数据库中的数据进行排列，然后，根据质谱仪检测标准品的误差值Ⅱ与误差值Ⅰ进行比对，选取误差值Ⅱ与误差值Ⅰ最为接近的数据库中的理论样品，通过该理论样品的信息即可获知待测低分子肝素样品的结构信息。