[发明专利]基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法有效
申请号: | 201310413981.8 | 申请日: | 2013-09-12 |
公开(公告)号: | CN103616502A | 公开(公告)日: | 2014-03-05 |
发明(设计)人: | 沈锡辉;王瑶;崔博宇;宋云洪;王铁涛;刘应保;司美茹 | 申请(专利权)人: | 西北农林科技大学 |
主分类号: | G01N33/53 | 分类号: | G01N33/53 |
代理公司: | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350 | 代理人: | 汤东凤 |
地址: | 712100 陕西省杨凌示范*** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | 本发明公开了一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法,构建荧光供体克隆pBluescript-pLac::luxAB-MCS;受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP等;在MCS处选择合适酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处;产生BRET信号的模式体;检测三个BRET模式体的荧光素酶的荧光强度;选择三个荧光强度值都较强的模式体作为BRET信号产生的荧光供体;通过生物荧光显微镜(Leica)检测荧光蛋白的表达情况,选择合适的荧光受体;通过荧光分光光度计检测BRET模式体的信号。本发明通过细菌荧光素酶luxAB作为检测两蛋白互作的荧光供体与eYFP作为荧光受体产生BRET信号,构建BRET模型,该系统可以在体内检测两个蛋白的动态互作,提高了检测蛋白质相互作用的准确性,作为检测原核细胞内蛋白质互作的较理想系统。 | ||
搜索关键词: | 基于 细菌 荧光 bret 技术 检测 蛋白质 相互作用 方法 | ||
【主权项】:
一种基于细菌荧光素酶BRET技术检测蛋白质相互作用的方法,其特征在于,该基于细菌荧光素酶BRET检测蛋白质相互作用的方法包括以下步骤:包括以下步骤:步骤一,构建克隆pBluescript‑pLac::luxAB‑MCS;步骤二,受体蛋白选择绿色荧光蛋白GFP、增强型黄色荧光蛋白eYFP、橙色荧光蛋白mOrange;步骤三,在MCS处选择酶切位点分别将三种荧光蛋白克隆到MCS处;步骤四,去掉luxB的终止密码子TAA,形成细菌荧光素酶和荧光蛋白的融合体;步骤五,分别得到pBluescript‑pLac::luxAB‑GFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑eYFP、pBluescript‑pLac::luxAB‑mOramge三个重组载体,产生BRET信号的模式体;步骤六,通过酶标仪检测三个BRET信号模式体荧光素酶的荧光强度;步骤七,选择三个模式体荧光强度值都较强作为BRET信号产生的荧光供体;步骤八,通过生物荧光显微镜Leica检测荧光蛋白,选择合适的荧光受体。
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