[发明专利]一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达。本发明提高粘红酵母油脂中亚油酸的含量。

主权项

一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：（1）粘红酵母进行活化和扩培；（2）采用同源序列克隆法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆并测序，获得目的基因vfFAD2；（3）目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121‑vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；（4）利用农杆菌介导法，重组载体pBI121‑vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μg•mL‑1链霉素，200 μg•mL‑1头孢霉素和100 μg•mL‑1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3‑5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μg•mL‑1头孢霉素，150 μg•mL‑1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3‑5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子，提取基因组DNA，PCR验证获得阳性转化子；（5）气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了102.86%。