[发明专利]柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，其步骤包括：(1)表达载体的构建；(2)目的蛋白的表达和纯化；(3)将纯化好的蛋白进行浓度调整，得到可直接使用的柱状黄杆菌基因重组亚单位疫苗。本发明所制备的疫苗具有安全性高、免疫效果稳定、生产效率高等优点。

主权项

一种柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法，所述的方法包括如下步骤：(1)合成表1所示的引物：表1所用到的引物(2)提取柱状黄杆菌基因组，以柱状黄杆菌的基因组DNA为模版，以表1所示的引物进行PCR扩增表达片段；(3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，分别连接到pMD‑18T质粒上；(4)pMD‑18T质粒分别进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取pMD‑18T质粒并进行双酶切，所使用的酶如表1所示；电泳切胶回收酶切片段；(5)将酶切下来的五个基因片段以等体积混合，使用T4连接酶进行连接；(6)将连接产物使用引物maz+和clsA‑进行PCR扩增以获得五个基因的连接产物；(7)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，将回收片段连接到pMD‑18T载体上。(8)对步骤(7)的pMD‑18T载体进行克隆，使用细菌质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切，所使用的酶为NcoI和SacI，电泳回收酶切片段；(9)将步骤(8)中双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pET‑32(a)表达载体连接；(10)连接产物转化DE3感受态细胞，PCR筛选重组克隆；(11)取阳性克隆菌液1：100接种于LB(含100μg／mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD600为0.4～0.6。(12)加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养6h；4℃，5000g离心15min，去上清，收集菌体；用PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心15min，去上清；加入1×结合缓冲液重悬菌体，冰上超生波破碎，200W，30s超声，30s间隔，8个循环；4℃，10000g离心15min，去上清，沉淀用含8M尿素的1×结合缓冲液重悬。冰上放置1h，使其彻底溶解；4℃，10000g离心30min，保留上清；(13)将树脂充分重悬，取悬液加到沉降柱中；依次3体积去离子水；5体积离子化缓冲液(50mmol／L NiSO4)润洗；3体积结合缓冲液(0.5mol／L NaCl，5mmol／L Imidazole，20mmol／L Tris‑HCl，pH7.9)润洗；待结合缓冲液降至层析介质表面时，加入制备好的上清样品，流速为每小时10倍床体积，10体积结合缓冲液漂洗，6体积漂洗缓冲液漂洗，6体积洗脱缓冲液洗脱目标产物，目标产物经得到可柱状黄杆菌基因重组疫苗。