[发明专利]一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法

摘要

本发明公开了一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）微生物初筛（2）微生物复筛（3）发酵培养（4）提取硫酸软骨素酶（5）软骨预处理（6）酶解超滤（7）制硫酸软骨素。本发明采用鱼软骨来提取鲨鱼硫酸软骨素，发酵产生的硫酸软骨素酶活力高，通过用硫酸软骨素酶酶解得到的小分子硫酸软骨素，具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利用度高等特点。酶解液使用超滤膜浓缩工艺，提高了产品的收率和纯度。本发明的提取方法操作方便、周期短，易于操作可实现大规模的工业化生产。

主权项

一种提取鱼软骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）微生物初筛：用无菌水将土样悬浮制成10%的土壤溶液，两层滤纸抽滤后得澄清液体，将液体梯度稀释至10^‑5，取稀释液0.3ml涂布分离培养基平板培养，将单菌落用平板划线分离方法在分离培养基平板上纯化2次，挑取纯化后的单菌落点种于初筛培养基平板，32℃温箱中培养6‑7天后，向平板中倒入6ml 3mol/L的冰醋酸，浸泡3min，将产生透明圈的菌株利用划线法保存于试管固体斜面培养基上并于4℃保存待用；（2）微生物复筛：将产生透明圈的菌体接种于复筛培养基中，32℃，135r/min振荡通气培养2天，将菌液梯度稀释至10^‑9，取0.3ml 10^‑7、10^‑8、10^‑9的菌液，涂布于初筛培养基中，在32℃温箱中培养6‑7天后，通过测量挑选透明圈相对于菌落较大的菌株，接种于复筛培养基中，32℃、135r/min振荡通气培养24h，经平板菌落计数得菌体密度为2×10⁷‑3×10⁷个/ml作为种子菌液，肉眼观察菌落的形态特征；（3）发酵培养：按2‑2.5% v/v接种量将种子菌液接入5L发酵罐中通过发酵培养基发酵，28‑32℃，发酵55‑65h；（4）提取硫酸软骨素酶：将所得发酵液置于离心机中，4℃、4200r/min离心35min,弃去菌体沉淀，冰浴，在磁力搅拌器的搅拌下，缓缓向发酵上清液中加入硫酸铵至90%的饱和度，4℃层析柜中静置2天,然后4℃、4200r/min再次离心发酵液，收集蛋白沉淀，利用三蒸水溶解并置于透析袋中，于4℃层析柜中透析脱盐，在(NH₄)₂SO₄溶液检测透析袋外液体不含SO₄^2‑的情况下，冷冻干燥；（5）软骨预处理：选择鱼软骨脱脂后将其粉碎，加入3‑5％的氢NaOH溶液和氯化钠溶液在温度为50‑60℃的条件下提取5‑6h，过滤后调滤液pH=8‑9 ；（6）酶解超滤：向上述滤液加入软骨投料重量3‑5％的步骤（4）制作的硫酸软骨素酶粉，在pH 值为6‑7，温度为40‑50℃的条件下酶解5‑6h，在室温下用截留分子量为8000的超滤膜超滤脱水浓缩至原体积的2/3 ； （7）制硫酸软骨素：将超滤脱水后的浓缩液调pH 值为8‑9，加入为软骨投料重量2‑3％的双氧水，在温度为25‑35℃的条件下氧化5‑6h过滤，滤液调pH 值为5‑6，加入95％乙醇结晶，使乙醇浓度达65‑75％，结晶后离心、洗涤、干燥后得到鱼硫酸软骨素。