[发明专利]一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法

摘要

本发明提供一种生物工程技术领域的鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，即，选鲤鱼进行解剖，无菌取头肾并剪碎，经细胞筛过滤得细胞悬液，后经离心洗涤，加入细胞培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代巨噬细胞多种方法镜检鉴定。本发明直接无菌取鲤鱼头肾，进行铺板法培养以提取巨噬细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代巨噬细胞，保证了所提取离体细胞的成活率，为进一步开展鲤鱼巨噬细胞毒理试验及其他实验打下基础。

主权项

一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：a．  细胞的提取：选择规格均匀、体格健壮的平均体重400‑600g的红鲤鱼预养2周；首先按组成为100 ml HBSS，1 ml 1%双抗储液，100 μl 10U/ml Heparin（肝素钠）储液配制Hank’s平衡盐工作液；还有培养基液，铺板法中所用对鲤鱼巨噬细胞的最适培养基液组成为：95ml Leibovitz’s L‑15培养基、5ml 5%FCS（小牛血清）、1ml 0.01 M Hepes缓冲液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）、1ml 1% 双抗储液、100μl 10 U/ml Heparin（肝素钠）储液；并用1 M NaOH储液调节pH至7.0‑7.4之间，然后用0.22 μm滤头过滤分装；然后解剖鲤鱼，无菌取头肾并置于Hank’s平衡盐工作液中重悬，用Hank’s平衡盐工作液清洗2‑3次至头肾发白，将头肾剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，经孔径为100 μm 细胞筛过滤得细胞悬液，用Hank’s平衡盐工作液以1000 rpm，5 min离心洗涤细胞2次后弃上清，加入细胞培养液，吹打使细胞重悬；用血小球计数板进行计数，并用细胞培养液稀释，以最适培养条件铺板法贴壁培养增殖，用培养液洗去未贴壁细胞，然后对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定；铺板法培养鲤鱼巨噬细胞的最适条件为：细胞悬液稀释到4×107cells/ml浓度，24孔板铺进1×107 cells/孔，26℃条件下贴壁培养24h；b.  细胞的鉴定：对得到的原代巨噬细胞镜检鉴定，分别用台盼蓝染色法、瑞氏‑姬姆萨染色法和非特异酯酶染色法进行鉴定。