[发明专利]一种快速获取大量优质神经干细胞的培养方法

摘要

本发明提供一种提高干细胞培养效率的方法，所述方法包括在亚磁环境下培养干细胞。本发明使用的方法在不影响细胞性质的前提下快速获得大量优质的干细胞，不会对细胞造成任何额外生物或化学污染，对解决干细胞治疗中细胞数量稀少问题及提高干细胞相关产品产量有重要意义。

主权项

1.一种提高神经干细胞培养效率的方法，所述方法包括：(1)亚磁细胞培养环境控制：在铝合金制作的支架上，用0.5mm厚，磁通透性为20000的磁屏蔽金属坡莫合金包裹制作成亚磁屏蔽箱，缠绕层数12层，箱体最终尺寸以长*宽*高计为470mm*641mm*6511mm，在箱体顶部开直径0.5mm的小孔，分别安装进气扇和出气扇，箱体边侧开门；将亚磁屏蔽箱被放置在细胞培养箱中，细胞培养箱的环境：温度37℃，湿度95％，CO2浓度5％；通过运行磁屏蔽箱顶部的风扇，箱体内的环境与外部进行交换，保持内外环境一致；亚磁环境的总磁场强度小于500nT；(2)神经干细胞原代培养：将小鼠处死，取出脑，浸泡在冰冷的HEM中；在体视显微镜下，取出SVZ区组织放在冰冷的HEM溶液中；用剪刀将组织破碎成大块，加6mL 0.05％胰酶后转移到15mL离心管中，37℃消化10min；在混悬液中加入等体积的胰蛋白酶抑制剂终止消化，室温静止3分钟后在100g离心5分钟；去上清液，在沉淀物中加入2mL NSA+/+，反复吹打把组织打散成单细胞悬液；细胞悬液用40μm滤网过滤，用额外2mL NSA+/+冲洗离心管和过滤网，获得的所有滤液转移到新的离心管中；再次在100g离心5分钟，去上清液，沉淀物用1‑2mL NSA+/+重悬获得细胞悬液；用血球计数板数计算细胞密度，按照80万细胞每T25细胞培养瓶接种，添加5mL NSA+/+；1000个细胞/孔，200μL NSA+/+，放在步骤(1)中的亚磁环境中培养7天以上；所述HEM溶液为：MEM一袋，HEPES 3.813g，加ddH2O至0.875L，添加2％双抗；所述NSA+/+溶液为：NSA‑/‑50mL，3.78mg/mL的Heparin 50μL，1μg/mL的EGF 100μL，0.1μg/mL的bFGF 50μL；所述NSA‑/‑溶液为：NSA 44mL，10％BSA 1mL，Proliferation Supplement 5mL，双抗1％；所述NSA溶液为：DMEM/F12一袋，Glucose 3.75g，碳酸氢钠1.125g，HEPES 1.192g，加ddH2O至0.9L；所述0.05％胰酶为：胰蛋白酶0.05g，EDTA 0.004g，加PBS 100mL；所述胰蛋白酶抑制剂为：胰蛋白酶抑制剂11.2mg，1mg/mL的DNase I 0.8mL，HEM 79.2mL；(3)神经干细胞传代：将步骤(2)得到的原代神经干细胞细胞在亚磁环境中培养7天后，收集所有的神经球，在100g离心5分钟；添加0.05％胰酶或accutase在常温消化3分钟，加入等量胰蛋白酶抑制剂，轻轻混匀，在100g离心5分钟；吸去上清后，加入1‑2mL NSA+/+，反复吹打制成成单细胞备悬液；按照10万细胞接种到60mm细胞培养皿，添加5mLNSA+/+；1000个细胞每孔，200μL NSA+/+，放在步骤(1)的亚磁环境中培养7天以上。