[发明专利]污水处理厂亚硝酸盐氧化菌荧光定量PCR检测方法

摘要

一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域。本发明可以对污水处理厂中两个属的亚硝酸盐氧化菌，即硝化菌属和硝化螺菌属进行检测，不仅可以分析总的亚硝酸盐氧化菌，而且可以分析各个属的动态变化。采用通用性好、成本较低的SYBR Green荧光染料法建立了亚硝酸盐氧化菌2个属的实时荧光定量PCR标准曲线。2条标准曲线的相关系数分别为0.998和0.997，扩增效率在100%到110%之间。利用建立的标准曲线对某污水处理系统中亚硝酸盐氧化菌进行监控和鉴定。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法。

主权项

1.一种污水处理厂亚硝酸盐氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：污水生物处理系统中的亚硝酸盐氧化菌包括硝化菌属和硝化螺菌属，分别定量检测这两个属的微生物数量，二者数量之和是亚硝酸盐氧化菌的总量；提取实际生活污水处理系统中活性污泥微生物的基因组DNA；采用硝化菌属和硝化螺菌属16S rDNA引物进行常规PCR扩增；将两个属的纯化回收的DNA扩增片段与载体连接，连接好的载体导入感受态细胞培养15-18h，挑取白斑进行重组菌落PCR验证；提取包含目的片段的质粒用作实时荧光定量PCR的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线；利用建立的标准曲线对污水处理厂中亚硝酸盐氧化菌进行定量检测；上述常规PCR扩增体系如下：上述实时荧光定量PCR扩增反应体系如下：当检测硝化菌属时采用硝化菌属的正向引物为TGCGACCGGTCATGG，反向引物为GGGCGGWGTGTACAAGGC；当检测硝化螺菌属时采用硝化螺菌属的正向引物为CCTGCTTTCAGTTGCTACCG，反向引物为GTTTGCAGCGCTTTGTACCG；上述硝化菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，62℃1min，72℃2min；硝化螺菌属常规PCR和实时荧光定量PCR扩增程序如下：95℃处理10min；35个循环反应，每个循环包括95℃1min，60℃1min，72℃2min。