[发明专利]重组艾塞那肽的生产工艺

摘要

本发明公开重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；其中，本发明还包括对Exendin‑4进行酰胺化处理的步骤。本发明利用了pET‑31b(+)本身的可以大规模，高产量的生产多肽的优点，保留了它的功能强大的启动子，克服了目前其他生产工艺中该蛋白产物容易形成包涵体的缺点，利用了肠激酶的切割特性在目的蛋白的N末端进行切割，切割后的蛋白质完全是具有天然序列的Exendin‑4。经过工程菌的发酵表达和目的蛋白的纯化后得到重组艾塞那肽。产量可以达到500mg/升以上，比目前最先进的工艺产量提高了20倍，且均为可溶性蛋白。

主权项

一种重组艾塞那肽的生产工艺，包括构建工程菌的步骤、发酵表达工程菌的步骤和纯化目的蛋白的步骤；其中，构建工程菌的步骤包括：（1）重组艾塞那肽多肽基因序列的人工合成：根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计编码艾塞那肽的核苷酸序列，改造为如SEQ ID No.1所示的目的基因；（2）MAG2010质粒：取pET‑31b(+)质粒，将pET‑31b(+)中的KSI融合基因序列完全删除，同时删除限制性内切酶AlwnI酶切位点和3’端组氨酸标记以及终止子，在删除的位置，取代以蛋氨酸‑6X组氨酸‑GB1标签序列‑肠激酶裂解位点序列，将改造的pET‑31b(+)形成的新质粒重新命名为Mag2010；（3）工程菌的构建：将艾塞那肽基因序列切割并纯化，然后克隆到改造好的Mag2010质粒中的肠激酶裂解位点序列，目的基因3’端添加有双重终止子，得到重组质粒pET‑31 b (+)‑艾塞那肽，将重组质粒pET‑31 b (+)‑艾塞那肽以CaCl2法转化受菌体BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培养基中进行培养，收集菌体，筛选阳性克隆，作为重组艾塞那肽融合表达的工程菌；发酵表达的步骤包括：（1）挑单菌落到30 mL 目标培养基中，31℃，200rpm活化过夜；（2）将30mL菌液接到200 mL 2XYT培养基中，32℃，200rpm 培养约2.6 hr；（3）以10％的接种量，接到5 L MMBL培养基中，32℃，240rpm培养约3 hr；（4）接到60 L发酵培养基中；（5）控制生长期pH为6.8；用搅拌速度及通气量使DO≥10% ；待培养基中葡萄糖的浓度降至0.2g/L时开始补料；当OD550达到10左右时加入13 mL 1M IPTG诱导，终浓度为0.2mM，把pH缓慢调至7.00，继续培养10 小时后结束；纯化目的蛋白的步骤采用离子交换层析‑Sephadex G‑50凝胶过滤层析‑三明治型的亲和层析进行分离和纯化；该工程菌经过发酵、纯化得到的重组艾塞那肽的产量达到500毫克/升的产率；其特征在于，对艾塞那肽进行酰胺化处理；所述酰胺化处理包括：将磁珠固定化的体系终浓度为1.0mM的羧肽酶Y，或者体系终浓度为1.0mM的羧肽酶A溶于N‑苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和体系终 浓度为0.4M的重组艾塞那肽，体系终浓度为5mM的 EDTA , 反应体系总体积共计500毫升， 在75℃下反应20个小时，8000rpm 离心5分钟，酰胺化的重组艾塞那肽，用HPLC进行纯化, 用10%‑100%甲醇或者乙腈溶液进行洗脱，收集样品，所得样品利用减压蒸发除去有机溶剂，重溶于醋酸盐缓冲液中，然后真空干燥得到白色粉末状酰胺化艾塞那肽，并于‑20℃保存；所述三明治型的亲和层析包括亲和层析一、酶裂解和亲和层析二，具体步骤如下：（1）亲和层析一：采用GE 公司的IgG‑ sepharose‑fast flow column,首先用3个柱体积的50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCI的缓冲液平衡柱子，然后将用相同缓冲液透析过的蛋白质上柱，用1倍体积上述缓冲液洗然后用5mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液洗去未结合的杂质，接着用500mM 乙酸钠，pH5.0的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，收集、浓缩，用足量的20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小时；（2）肠激酶处理：1 μl的重组牛肠激酶轻链亚基在20℃，20mM Tris‑HCl，100mM NaCl，pH7.6的条件下8h可以完全切割融合蛋白；（3）亲和层析二：将上述处理过的重组艾塞那肽结合在镍柱上，先用起始缓冲液洗脱磷酸盐缓冲液，保留洗脱组分，浓缩，冷冻干燥，得到重组的艾塞那肽。