[发明专利]一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法和装置

摘要

本发明公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，首先对样品进行横向二维扫描，根据得到荧光寿命分布和荧光光斑进行横向对准，然后对单颗荧光颗粒进行轴向扫描成像，分析带有荧光强度与寿命分布的轴向二维图像，调节连续损耗光的发散度，完成光斑的轴向对准。本发明还公开了一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准装置。本发明装置结构简洁，方便快速高精度调整，无需因采用纳米金颗粒而添加额外探测光路；调节精度高，光斑对准精度可达纳米量级。

主权项

一种基于荧光寿命分布的纳米精度光斑对准方法，适用于具有脉冲激发光和连续损耗光的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括以下几个步骤：1）同时启用脉冲激发光和连续损耗光，所述的脉冲激发光和连续损耗光转换为圆偏光后经显微物镜聚焦到荧光样品表面，收集荧光颗粒发出的荧光，得到聚焦点的荧光强度和荧光寿命；2）横向移动所述的荧光样品，重复步骤1），获得对应扫描区域内各扫描点的荧光强度信息和荧光寿命信息；3）对步骤2）获得的荧光强度信息和荧光寿命信息进行分析，选择单颗荧光颗粒的荧光强度光斑、拟合光斑中心并记录光斑中心坐标，同时提取所述荧光强度光斑对应的寿命分布，拟合寿命的最长点并记录最长点坐标，计算得到光斑中心与寿命最长点的距离；4）根据步骤3）算得的距离，改变所述连续损耗光入射显微物镜的角度，使光斑中心与寿命最长点完全重合，完成光斑的横向对准；5）对步骤3）中选择的单颗荧光颗粒，重复步骤1）中的操作，选取穿过颗粒中心的轴向切面进行扫描，并移动所述的荧光样品完成轴向二维扫描，获得对应各点的荧光强度信息和荧光寿命信息；6）根据步骤5）中单颗荧光颗粒的椭圆荧光光斑及荧光光斑对应的寿命分布，调节所述连续损耗光的发散度，使得长寿命区域贯穿荧光光斑的中间区域且沿椭圆荧光光斑长轴和短轴呈轴对称分布，完成光斑的轴向对准。