[发明专利]一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法

摘要

本发明公开一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵工程技术领域。采用自行构建并表达rPoIFNα1的重组大肠埃希菌BL21/pET-32a-rPoIFNα1作为生产菌种，在37℃发酵2~3h后，按每升发酵液一次性添加浓度为50g/L~100g/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后，再32℃培养4~5h结束此过程。本发酵方法可以实现rPoIFNα1的高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上，效价高达1×106IU/ml以上，且为可溶性蛋白，避免了包涵体表达需要变复性难题，缩短了生产周期，为rPoIFNα1的工业化生产奠定了坚实基础。

主权项

一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于包括以下步骤：（1）种子菌培养：将­­‑18~‑20℃保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度36~38℃，初始pH值6.8~7.2，培养时间9.5~10h；（2）发酵：将培养好的种子液按接种量1‑2%接入发酵罐进行发酵，发酵培养基量为18~22L，即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.4~1.6L/min，保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度37℃，机械搅拌转速为210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0~7.1；（3）补料：发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD600为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH4）2SO4 1~5g，添加2~4次；（4）诱导：补料2~3h后，紫外分光光度仪测定OD600为1.0时，一次性添加浓度为50~100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH4）2SO4  2~10g，然后将温度调至32℃进行目的蛋白的诱导表达4~6h；（5）革兰染色及菌体湿重的测定：诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml；（6）第一次离心：在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀；（7）重悬沉淀的菌体：重悬时每100g湿重菌体加1L的1×PBS（NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 2.9g/L，KH2PO4 0.2g/L）；（8）破碎菌体：用机械破碎的方法，破碎时用800 bar的压力连续对菌体冲撞3~4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上；（9）第二次离心：在转速为12000r/min，温度为4℃的条件下离心14~16min后取上清液；（10）超滤浓缩：将第二次离心得到的上清液使用0.22μm孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNα1的粗制品。