[发明专利]一种杏抗寒基因转化的方法

摘要

本发明涉及一种杏抗寒基因转化的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。该方法是采用花粉管导入转化杏抗寒基因的方法，其步骤包括：(1)提取质粒DNA；(2)采集与处理待授粉的花粉；(3)利用含有目的基因的花粉对受体进行杂交授粉；(4)获得与扩繁转基因植株；(5)检测转基因杏组培苗。本发明利用花粉管通道法成功转化杏抗寒基因，获得了转基因植株，提高了杏树抗寒特性，同时丰富了抗寒杏的新种质资源。

主权项

1.一种杏抗寒基因转化的方法，其特征在于：采用花粉管导入转化杏抗寒基因，其步骤包括：(1)提取质粒DNA：所用含有目的基因的农杆菌菌株LBA4404是含有35S启动子、目的基因、终止子NOS和标记基因NPTII的双元载体pCAMBIA2300-35S-AmEBPl，(中国科学院遗传发育所惠赠)在超净工作台上挑取保存的菌体接种在YEP固体培养基上培养，菌板置于恒温培养箱，28℃培养2～3d，至单菌落产生；挑取单菌落接种于YEP液体培养基，在恒温摇床上28℃、200～210r/min过夜培养(24h左右至对数生长后期)，待OD600值为0.5～0.8时可用于质粒DNA的提取；采用裂解法提取质粒DNA，将DNA提取液稀释100倍，用UV-2450紫外可见分光光度计测定其在波长260nm和280nm波长下的吸收值，OD260/OD280=1.8～1.9为高纯度DNA，＞1.9则有RNA污染，＜1.8说明有蛋白质污染；DNA浓度按以下公式计算：DNA浓度(ng/μL)=OD260×50×稀释倍数；将质粒DNA用0.1％TE溶液稀释为200μg/mL、500μg/mL、800μg/mL三种浓度，分装好贮藏在-20℃冰箱中备用；(2)采集与处理待授粉的花粉：选取凯特杏作为授粉父本品种，在母本树(岱玉杏)开花期前1～2天，采剪健康父本(凯特杏)花枝带回室内水培，大蕾期收集花药备用，有两种处理方式：处理一：利用携抗寒基因的基因枪轰击花药后，阴凉晾干，收集花粉4℃低温保存；处理二：将花药与DNA溶液混合后，收集花粉4℃低温保存；(3)利用含有目的基因的花粉对受体进行杂交授粉：对母本树(岱玉杏)大蕾期花授粉，授粉时间在早上8：00～10：00时，选择即将开放但还未开放的花蕾，拨开花瓣，用橡皮头蘸取花粉，选择雌蕊发育正常的花进行人工授粉，每个小枝去掉不完全花和未开好的花，保留3～5朵花，其余的花全部剪除；授粉后4～5小时，对花柱采取剪去1/2、不剪和全剪3种处理方式，取浓度为200μg/mL、500μg/mL、800μg/mL质粒DNA溶液，涂抹柱头2～3次；(4)获得与扩繁转基因植株：取生长一定时期的幼胚，自来水冲洗干净后，用70％乙醇浸泡30～60秒，再用0.1％氯化汞浸泡6～8分钟，然后用无菌水洗涤4～6次，灭菌期间不断晃动幼胚，以保证表面灭菌彻底，灭菌后的幼胚接种到改良WPM培养基上，7～10d后切取小苗继续转接到改良WPM+200mg/L Cef+60mg/L Kan抗性筛选培养基上进行诱导筛选；对已获得筛选的苗木在MS+IBA0.4mg/1培养基上生根，获得转基因苗木；(5)检测转基因杏组培苗分子：取杏幼嫩叶片组织约0.3g，CTAB法提取植物DNA，加TE溶液溶解，于-20℃保存；以提取的转基因杏叶片DNA为模板，以质粒DNA作为阳性对照，以未经转化的杏叶片DNA作为阴性对照，进行PCR扩增检测，其中：目的基因引物序列为：引物1：5′-ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3′，引物2：5′-TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3′；所用反应体系见表1：表1：扩增程序为：扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察；对PCR检测结果阳性的转基因植株和未转基因的对照植株采用PCR标记法进行Southern检测，其具体方法：用NotI和SacI双酶切pATCBG2质粒DNA，DIG-dUTP标记(地高辛杂交检测试剂盒)，得到800bp的片段为标记探针；预杂交：取10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-100)，加入杂交管中，60℃杂交炉中预杂交2h；探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10分钟，立即放冰水浴冷却5min；杂交：排尽预杂交液，在10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-100)加入4.0μl新变性好的探针，混匀，60℃杂交仪中杂交过夜；洗膜、信号检测：使用美莱博DIGD-110“地高辛杂交检测试剂盒II(化学发光法)”。