[发明专利]诱导子在西洋参发状根中的应用方法

摘要

本发明涉及一种诱导子在西洋参发状根中的应用方法，属于作物生物技术领域。该过程包括以下步骤：(1)西洋参发状根的诱导；(2)西洋参发状根无性体系生长动态及人参皂苷含量测定；(3)西洋参发状根培养条件的优化；(4)诱导子的制备；(5)代谢途径中酶活力的调控。本发明提出了西洋参发状根培养条件的组合，以及研究了水杨酸、茉莉酸甲酯两种诱导子对西洋参代谢的影响，以提高皂苷产量，为西洋参皂苷的大规模培养提供了依据，为实现西洋参皂苷的工业化生产奠定了基础，以此满足人们日益增长的需求。

主权项

一种诱导子在西洋参发状根中的应用方法，其特征在于：其过程包括以下步骤：(1)西洋参发状根的诱导：(1a)外植体处理：(I)西洋参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经开裂的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％升汞消毒6min，无菌水清洗5次，将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料；(II)西洋参三年生根的处理：将西洋参三年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min后，无菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用；(1b)菌种保存、活化及培养：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌溶于甘油中，于‑20℃条件下保存；短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存；无菌条件下，接种针挑取保存菌液，于相应的平板上划线培养，28℃置于黑暗条件下培养，直到长出单菌落；挑取一个单菌落接种于50ml液体YEB培养基中，120r／min、28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出；取1ml已活化的菌液加入50ml的YEB液体培养基中，120r／min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期，此时菌液就可以作为感染用；(1c)西洋参发状根诱导培养：(I)西洋参实生苗的转化方法，包括：①外植体预培养：西洋参实生苗消毒后，将其切成1.0cm的叶片、带叶幼茎和茎段，将这些片段接于MS+NAA2mg／L培养基中黑暗条件下培养0～96h用于感染材料；②感染与共培养：在超净工作台上，将预培养的外植体，转移到装有备好的感染菌液的三角瓶中，封口后放在120r／min，暗条件下的摇床上感染10～30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25℃条件下共培养0～96h；③除菌培养：将共培养后的感染材料用无菌水清洗三遍，无菌滤纸吸干外植体表面的无菌水，将其转接到含有头孢霉素500mg／L的MS固体培养基上培养，于黑暗、25℃条件下除菌培养；(II)西洋参三年生根的感染与诱导培养：用微量移液器吸取活化好的三种菌株8μl滴到已接到MS固体培养基的西洋参三年生根切片上，避免菌液滴到MS固体培养基上，25℃，黑暗条件下培养；2周后除去褐化死亡的根切片，转移到新鲜的MS固体培养基上继续培养；(2)西洋参发状根无性体系生长动态及人参皂苷含量测定：(2a)发状根生长动态测定：发状根培养采用MS液体培养基为基本培养基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)，将12条生长旺盛的约5cm的发状根根尖接入装有30mlMS培养基中， 温度为24±1℃，摇床转速100r／min，每隔三天取样，测定发状根干重及人参总皂苷的含量，测定一个月生长周期，所有数据为3瓶的平均值，重复两次；(2b)标准曲线法对发状根中总皂苷的测定：(I)标准曲线的绘制：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为2mg／ml；②取Rgl对照品溶液30、60、90、120、150μl；③分别置于5支试管中(10ml，具塞)，甲醇定容为150μl，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在751分光光度仪544nm处检测；以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y=503.29X+4.456，R2＝0.9924求得样品皂苷含量(％)；(II)发状根中总皂苷的测定：取一定量液体培养的新鲜发状根，蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干发状根表面的水分，称量发状根鲜重，然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，称量；将干燥后的发状根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂，并将三角瓶口用封口膜密封，置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声频率为28KHz，提取两次；在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H2S04染色，60℃恒温水浴10min，冰水浴15min，于544nm处测吸光度；(3)西洋参发状根培养条件的优化：(3a)不同培养基对西洋参发状根生长及总皂苷合成的影响：分别用4种液体培养基MS、改良White、SJ‑1和B5培养西洋参发状根，一个月后测定发状根的生长倍数及总皂苷含量，比较不同培养基对发状根的生长及次生代谢产物合成的影响；(3b)碳源对西洋参发状根生长量及总皂苷含量的影响：在MS液体培养基条件下，分别采用3％的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和半乳糖，一个月后测定西洋参发状根生长量及总皂苷含量；(3c)pH值对西洋参发状根生长量及总皂苷含量的影响调节液体MS培养基的初始pH值，使其分别为：5.0、5.5、5.8、6.0、6.5、7.0，一个月后测定发状根的生长量及总皂苷含量；(4)诱导子的制备：(4a)水杨酸的准备及添加：水杨酸用蒸馏水溶解，配制成0.2mg／L，0.4mg／L，0.6mg／L，0.8mg／L及1.0mg／L五个浓度，加入培养基中，在接种的第9天加入，在加入后24h、36h、48h收获，测定鲜重、干重及皂昔含量，确定水杨酸的最佳添加浓度，然后以此最佳浓度在培养物生长对数时期添加，测皂苷含量以确定水杨酸添加作用时间；(4b)茉莉酸甲酯的准备及添加：茉莉酸甲酯用蒸馏水配制成5umol／L、10umol／L、 15umol／L、20umol／L及25umol／L五个浓度，加入培养基中，在接种的第9天加入，在加入后24h、36h、48h收获，测定鲜重、干重及皂苷含量，确定茉莉酸甲酯的最佳添加浓度，然后以此最佳浓度在培养物生长对数时期添加，测皂苷含量以确定茉莉酸甲酯的最佳作用时间；(4c)水杨酸和茉莉酸甲酯协同作用：进行试验设计，各因素水平见表1：表1各因素水平(5)代谢途径中酶活力的调控：(5a)过氧化物酶活力的测定：①酶液的提取：称取添加诱导子的西洋参发状根0.5g于研钵中→加入2mL磷酸缓冲液→研成匀浆转入离心管中→再加3mL磷酸缓冲液冲洗研钵→转入离心管中→等重→8000r／min离心10min→取上清液转入25mL容量瓶中→沉淀用5mL磷酸缓冲液再提一次→上清液并入25mL容量瓶→定容；②过氧化物酶活力的测定；③结果计算：以每分钟光密度(OD470nm)变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：过氧化物酶活力=△OD470nm／(0.01×t)×D；其中t为反应时间；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数；(5b)过氧化氢酶活力的测定：①酶液的提取：称取添加诱导子的西洋参发状根0.5g于研钵中→加入2mL磷酸缓冲液→研成匀浆转入离心管中→再加3mL磷酸缓冲液冲洗研钵→转入离心管中→等重→4000r／min离心15min→取上清液转入25mL容量瓶中→沉淀用5mL磷酸缓冲液再提一次→上清液并入25mL容量瓶→定容；②过氧化氢酶活力的测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，一支为空白管，按表2顺序加入试剂，25℃预热后，逐管加入0.3ml0.1mol／L的H2O2，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min；表2过氧化氢酶活力测定管号S1S2S3粗酶液(ml)0.40.40.4pH7.8磷酸(ml)333蒸馏水(ml)222(5c)结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活力单位(u)；过氧化氢酶活性(u·g‑1min‑1)=(△A240×VT)／(0.1×V1×t×FW)；式中△A240＝As0‑(As1+As2)／2；As0‑加 入煮死酶液的对照管吸光值；As1，As2‑样品吸光值；Vt‑粗酶提取液总体积(ml)；V1‑测定用粗酶液体积(ml)；FW‑样品鲜重(g)；0.1‑A240每下降0.1位1个酶活力单位(u)；t‑加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。