[发明专利]高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生及用其生产甘草次生代谢产物的方法

摘要

本发明涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌外植体的获得：取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；（2）发根农杆菌工程菌液的制备；（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生。本发明提供了一种高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，并对获得的甘草毛状根选用适当的液体培养基进行悬浮培养并应用于生产药用次生代谢产物（甘草苷和甘草酸等）。

主权项

一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌外植体的获得：取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；（2）发根农杆菌工程菌液的制备：取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液OD600值为0.6～0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液OD600值为0.6～0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100～150μM，制成工程菌液待用；（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生：按照步骤（1）中获得的外植体，经步骤（2）中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h～48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10～15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。