[发明专利]一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法

摘要

一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，步骤为：细胞裂解处理；RNA的逆转录处理；生成cDNA，并成为RNA扩增模板；通过定期监测荧光信号，来对RNA扩增子进行定量；本发明采用等温反应法，对BRAF的V600E突变位点进行定点特异检测，其中温度等温41℃进行，试验条件温和，反应化合物普通，操作简单，特异性高，仅需要能检测荧光探针的仪器即可。它有一个更高的放大系数，能够在1.5小时之内用2条针对靶向RNA的特异性引物和三个酶，制造出十亿个与目标RNA互补的RNA，通过荧光探针的检测，读出低至0.1％含量的BRAF突变信息，用于肿瘤患者靶向药物的用药指导。

主权项

1.一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测准备：①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存；②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；③DNA引物和探针：所用的对应突变型BRAF V600E的正向引物序列为：5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3；所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3；所用的BRAF的反向引物序列为：5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；所用的分子信标的序列为：5-FLUOROPHORE-GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC-QUENCHER-3；(2)检测程序：①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜，突变型BRAF V600E的正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)各1mM，检测到的结果是突变型BRAF的含量；如果加入的引物是野生型BRAF正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3)和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)，那么检测到的结果就是野生型BRAF的含量；③将反应混合液(未加入样本)加入到微测试孔中，每孔19μl；④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF V600E或者野生型BRAF的含量。