[发明专利]基于液质联用检测膜蛋白与配体亲和力的混合物筛选方法

摘要

本发明公开了一种基于液质联用的膜蛋白与配体亲和力测定方法。该方法为a）把纯化的膜蛋白组装到生物膜模拟系统Nanodisc中并去除去垢剂；b）将组装有膜蛋白的Nanodisc和化合物进行孵育处理；c）用重复超过滤方法将与膜蛋白有非共价结合的化合物富集于过滤膜上部；d）用液质联用仪器检测过滤膜上部化合物浓度来鉴定与膜蛋白有非共价结合的化合物。本发明提供了一种通过将膜蛋白组装到生物膜模拟系统进行样品处理，并利用液质联用技术测定小分子化合物和膜蛋白结合亲和力的方法。该方法具有不依赖任何的标记，不需要经过固定化等步骤，通量高，样品需求量小，可对混合物进行筛选，操作简单，灵敏度高等特点，适用于不同种类的膜蛋白检测，有很好的通用性。

主权项

一种基于液质联用检测膜蛋白与配体亲和力的混合物筛选方法，其特征在于，按如下步骤进行：首先，构建可以高表达A2A腺苷受体的昆虫表达质粒，并把该质粒在昆虫SF9表达系统中进行高效表达，通过提膜、溶膜、过柱纯化制备得到溶于去垢剂的纯度高于90％的A2A腺苷受体蛋白；随后，将纯的A2A腺苷受体蛋白组装到生物膜模拟体系中，并通过疏水柱去除去垢剂，得到的生物膜模拟体系，经浓缩到一定浓度后与待筛选的含多种化合物的的混合物按一定比例进行混合孵育，同时，利用未组装A2A腺苷受体的空生物膜模拟体系作为对照；随后，用多次超过滤方法，将与膜蛋白有非共价结合的化合物富集于超过滤管上部，将经超滤管富集后的结合有化合物的膜蛋白样品经处理后，取上清用液质联用仪器检测其中每种化合物的相对含量，由此测得每一种与膜蛋白有非共价结合的化合物与膜蛋白的相对亲和力大小，并从中筛选出与膜蛋白的相对亲合力达一定值的配体化合物；将纯的A2A腺苷受体蛋白组装到生物膜模拟体系Nanodisc中并去除去污剂的具体方法如下：选择一个组装体系，取预先溶解在氯仿中的POPC液体放到EP管中，并用氮气缓慢吹干，使得氯仿完全挥发；待POPC准备好后，在EP管中加入胆酸钠，胆酸钠预先溶解于20mM Tris,100mM NaCl,pH 7.4的缓冲液A中，水浴加热促进溶解；待POPC完全溶解后，放置在冰上冷却，然后加入膜支架蛋白,并加入缓冲液A，组装得到不含A2A受体蛋白的Nanodisc作为空白对照；对于含A2A腺苷蛋白的Nanodisc，则加入A2A腺苷受体蛋白，最后用缓冲液A补充总体系体积；将组装混合体系孵育之后，加入预先用缓冲液A处理过的纯化珠子，加入纯化珠子后，将EP管放到旋转仪上，缓慢旋转去除去污剂；组装好后，静置，吸取上清，并再次加入缓冲液A到纯化珠子中，轻轻混匀，静置后吸取上清，重复上述清洗过程，尽可能地回收Nanodisc。