[发明专利]一种呋喃妥因化学发光检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测呋喃妥因化学发光检测试剂盒，包括浓缩洗液、阴性对照品、阳性对照品、化学发光液、呋喃妥因标准品、辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体和已包被呋喃妥因的发光板；所述的辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体为，辣根过氧化物酶标记的以呋喃妥因-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔所得抗呋喃妥因多克隆抗体；用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体；本发明检测呋喃妥因化学发光检测试剂盒灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速且无毒无污染；采用呋喃妥因的代谢物与载体偶联制备包被抗原，更为经济；辣根过氧化物酶标记物的制备，采用一步法，方法简单步骤更为简单，利于工业化生产。

主权项

一种呋喃妥因化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括浓缩洗液、阴性对照品、阳性对照品、化学发光液、呋喃妥因标准品、辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体和已包被呋喃妥因的发光板；所述的浓缩洗液为：含有Tween‑20和氯化钠的磷酸盐缓冲液；所述的阴性对照品为：5份以上单独存放的除菌过滤后的呋喃妥因检测为阴性的猪尿混合物；所述的阳性对照品为：5份以上单独存放的除菌过滤后的呋喃妥因检测为阳性的猪尿混合物；所述的化学发光液，包括A液和B液；A液配制方法为：首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris‑HCl缓冲液，在此缓冲液中加入鲁米诺和四苯硼钠，混合均匀即可得到A液；B液配制方法为：首先配置0.2 mol/L pH7.8的Tris‑HCl缓冲液，在此缓冲液中按重量比加入0.1% H2O2混合均匀即可得到B液；所述的呋喃妥因标准品为浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、0.3 ng/ml、0.9 ng/ml、2.7 ng/ml、8.1ng/ml呋喃妥因的稀释液；所述的辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体为， 辣根过氧化物酶标记的以呋喃妥因‑BSA为免疫原免疫新西兰大白兔所得抗呋喃妥因多克隆抗体；用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体，反应体系为：先用1ml浓度5mg/ml的辣根过氧化物酶溶液与0.15ml浓度0.1 mol/L 的NaIO4溶液混匀后，置于4℃避光0.5小时，然后加入0.25ml的乙二醇摇匀室温避光1小时，然后置于4℃透析过夜，之后用0.2ml 浓度0.2 mol/L，pH值为9.6 的碳酸盐包被溶液将透析后得到的醛化辣根过氧化物酶溶液调pH值为9.2‑9.5，将5mg抗呋喃妥因多克隆抗体溶于1.0ml浓度0.01 mol/L，pH9.6的包被液后立即加入上述醛化后的辣根过氧化物酶溶液中于37℃反应1小时，然后加入0.1ml浓度 3.5mg/ml的NaBH4溶液，混匀于4℃放置2小时，用凝胶过滤层析进行纯化后，选择效价≥1：1000的无色或带棕色澄清液体，即为辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因特异性抗体；所述的呋喃妥因‑BSA免疫原的制备方法为：步骤一、免疫原制备：步骤一、称10mg对氨基苯甲酸溶入1.1mL 0.2 mol/L HCl中，置于0‑4℃搅拌至完全溶解，得到对氨基苯甲酸溶液；然后称取6mg的NaNO2溶在0.35mL的蒸馏水中，置于0‑4℃搅拌至完全溶解，得到NaNO2溶液；将NaNO2溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1小时，得混合溶液A；  步骤二、称取0.3‑1.2mg的呋喃妥因溶在10mL含NaCl的硼砂缓冲液中，置于0‑4℃下搅拌至完全溶解，得到混合溶液B；将上述步骤所得混合溶液A解逐滴加入到混合溶液B中，避光反应2小时，得到桔黄色溶液C；所述含NaCl的硼砂缓冲液中，硼砂的浓度为0.05mol/L，pH值为8.5，并含有浓度为0.15mol/L的NaCl；步骤三、在桔黄色溶液C中添加H3BO3晶体调节其pH值至7.4，然后加入94mg 牛血清白蛋白、 80mg碳二亚胺和4mg N‑羟基琥珀酰亚胺，然后置于室温搅拌2小时，得桔黄色溶液D； 步骤四、将上述步骤所得桔黄色溶液D转移到透析袋中，用0.01mol/L，pH为7.4的PBS缓冲液，在0‑4℃下透析五天，每12小时更换一次PBS缓冲液；将透析后的溶液冻干，得到淡黄色固体粉末即为免疫原呋喃妥因‑BSA，将其置于‑20℃保存，备用；所述的已包被呋喃妥因的发光板的制备方法为：步骤一、将呋喃妥因与卵清蛋白进行偶联得到免疫原：（1）称取9mg的NaNO2溶于0.3mL的蒸馏水中，得到NaNO2溶液；称取10mg 呋喃妥因溶在1.6mL 0.2mol/L的盐酸中，0‑4℃搅拌至完全溶解，得到呋喃妥因溶液；然后将所得NaNO2溶液逐滴加入所得呋喃妥因溶液中，避光反应0.5小时；  （2）反应结束后，加入25mg硫酸胺直至无氮气放出，即得到重氮化的呋喃妥因溶液；（3）称70mg卵清蛋白溶解在4mL的0.1mol/L，pH值为7.5的PBS磷酸缓冲溶液中，得到卵清蛋白溶液；然后将上述步骤所述的重氮化的呋喃妥因溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，得到混合溶液E；接着用1mol/L的氢氧化钠将混合溶液E的pH至调至7.5，然后置于0‑4℃下，避光反应18小时；  （4）将上述步骤避光反应后的反应液转移到透析袋中，用0.01mol/L，pH值为7.4的PBS缓冲液，在0‑4℃下透析五天，每12小时更换一次PBS缓冲液；然后将透析液3000转/分离心15分钟，冻干上清液，得到淡黄色固体粉末即为包被抗原呋喃妥因‑OVA，将其置于‑20℃保存，备用；步骤二、包被：（1）用0.05 mol/L，pH值为9.6的碳酸盐包被溶液将包被抗原配成1.5μg/mL的溶液，并向每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，之后4℃下过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次5分钟；（2）用封闭溶液封闭上述已包被的聚苯乙烯板，250μL/孔，37℃孵育1小时后洗涤，得到已包被呋喃妥因的发光板。