[发明专利]一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法

摘要

本发明公开了一种方格星虫多糖的硫酸化修饰方法。方格星虫多糖具有抗菌、抗病毒、抗辐射、增强机体免疫力等功能。多糖的活性直接或间接地受到其分子结构的影响，对多糖分子结构进行适当修饰可以改变多糖的活性，提高其功效。本发明用氯磺酸-吡啶法对方格星虫多糖进行硫酸化修饰，通过方格星虫多糖的纯化，方格星虫多糖的硫酸化修饰等具体技术措施，得到方格星虫硫酸酯化多糖，采用纸片扩散法，以6种细菌为指示菌，对方格星虫多糖和最优修饰条件所得硫酸酯化多糖进行了抗菌活性测定。抗菌试验结果显示，本发明方法所得的方格星虫硫酸化分子修饰产物，能进一步提高方格星虫多糖的抗菌活性。

主权项

一种方格星虫多糖硫酸化修饰方法，具体技术步骤是：（1）方格星虫多糖的纯化1）纤维素柱层析 取方格星虫粗多糖进行纤维素柱层析，按常规柱层析操作方法，取方格星虫粗多糖0.5g溶于10mL超纯水上样，用0.3‑0.5moL/L NaCL洗脱，流速为1mL/min，得到洗脱液，用玻璃纸透析除去盐分，减压浓缩至温度30℃相对密度是0.9829 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1‑5%的方格星虫多糖冻干品备用； 2）凝胶柱层析 取方格星虫多糖冻干品用超纯水溶解，0.45μm滤膜过滤，按常规方法进行凝胶柱层析，用超纯水以 0.2 mL/min流速洗脱，得到洗脱液，减压浓缩至温度为28℃时测得相对密度是0.9856‑0.9918 g/mL，进行冷冻干燥，得到含水量是1‑5%的纯化的方格星虫多糖备用；（2）方格星虫多糖的硫酸化修饰1）硫酸化试剂制备  将附有冷凝装置和磁力搅拌的三颈烧瓶置于冰盐浴中，加入10‑15 mL的吡啶，较为剧烈的搅拌5‑10 min，按氯磺酸与吡啶是1:6‑10的体积比，于40min内边搅拌边逐滴加氯磺酸至吡啶中，至出现大量淡黄色固体，反应结束，得酯化试剂备用；2）硫酸化修饰操作  精确称取0.500g纯化的方格星虫多糖，混溶于35mLDMF中，以磁力搅拌器搅拌30min混成均匀的悬液，倒入酯化试剂中并搅拌在水浴中使其反应，水浴温度是45‑70℃，反应时间是2‑4小时，反应结束后冷却至室温，将反应液倒入预冷至0‑4℃的100mL冰水中，用15%的NaOH中和至pH7.0‑7.2，加入三倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，热水溶解沉淀，流水透析48h，冷冻干燥至含水量为1‑2%，得到方格星虫硫酸酯化多糖（sulfated SPS，sSPS）。