[发明专利]一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，动物类药材制取方法领域。取珍珠母生品，加入蒸馏水，加热回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至适量后，冻干成粉，即得珍珠母生品冻干粉。将其冻干粉经Sephadex LH-20和反相硅胶C8的两次柱层析的分离纯化及高效液相色谱的进一步纯化得到一个单体寡肽化合物。经现代质谱技术和肽键裂解规律得到分子量为302的寡肽。为首次从珍珠母中分离得到。本发明的珍珠母寡肽具有一定的抗氧化活性，并对珍珠母炮制前后抗氧化性和其所含的总肽及含糖量进行了测定，结果显示珍珠母炮制品的抗氧化活性强于生品，是生品抗氧化性的七倍。具有广泛推广的意义。

主权项

一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征在于：步骤一、取珍珠母超微粉100目～200目生品，即准备用来进行炮制的样品，加入蒸馏水,分数比为超微粉：蒸馏水=1:10，加热至90℃回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至浓度为65%后，冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉；步骤二、将珍珠母生品冻干粉进行SephadexLH‑20凝胶柱分离，检测得到30个流分；分别对30个流分进行薄层分析，分析结果为流分Fr.5～Fr.13的薄层显色是相同的，将薄层显色相同的流分Fr.5～Fr.13合并，将合并后的流分冻干成粉；步骤三、将步骤二中得到的冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，并采用自动流分收集器收集，收集到波长为220nm、流速为3mL/min、5mL/管的自动接样流分，总共收集到55个流分，色谱图显示有三个一样高的小峰，对该三个一样高的小峰进行薄层分析，分析结果显示为阳性的流分与色谱图相对应，为Pe‑30～Pe‑35，将Pe‑30～Pe‑35的流分合并，并将合并后的流分冻干成粉；步骤四、对步骤三中得到的冻干粉通过反相HPLC色谱分离系统进一步分离纯化,以1‰甲酸乙腈洗脱，选用VenusilASB‑C18反相柱，在210nm下检测，经反相HPLC色谱分离，选取时间为5.940min时的色谱峰，该色谱峰为寡肽1即得到珍珠母寡肽1，收集并保留寡肽1样品，将寡肽1样品冷冻干燥，得到寡肽1冻干粉；步骤五、为了鉴定珍珠母寡肽1的结构，将步骤四中制得的珍珠母寡肽1冻干品用甲醇溶解后过膜，将过膜后的珍珠母寡肽1放进液质联用仪内，通过一级质谱图和二级质谱图及肽类裂解规律得出该寡肽1分子量为302，系由丙氨酸、缬氨酸和天冬酰胺三个氨基酸组成的三肽，化学式为H2N‑Ala‑Val‑Asn‑COOH，这是首次从珍珠母中分离得到的。