[发明专利]基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay）快速检测方法和检测试剂盒；方法包括下列步骤：首先用2.5μg/mL的抗OTA多克隆抗体100μL包被酶标板（黑色底透）；用1×PBST200μL洗涤后，用1×BSA PBS封闭酶标板；用1×PBST200μL洗涤后，加入被检测抗原样品溶液100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入生物素标记的抗OTA单克隆抗体100μL；用1×PBST200μL洗涤后，加入100μL1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素；用1×PBST200μL洗涤甩干后，用荧光分光光度计（390nm激发波长，605nm发射波长），测定相对荧光强度（RFU），根据样品的RFU代入标准曲线，得出样品的OTA含量。本发明所建立基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA快速检测方法，具有准确、快速、荧光稳定性好、灵敏、特异性高的特点。

主权项

一种基于量子点的赭曲霉毒素A的sFLISA快速检测方法，其特征在于：兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体作为检测抗体，量子点标记的链霉亲和素作为荧光探针，通过亲和素‑生物素之间的级联放大效应，能灵敏特异地进行赭曲霉毒素A的定量检测，与黄曲霉毒素B1等无交叉反应；具体包括下列步骤：（一）兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的包被用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5μg/mL包被酶标板，每孔100μL，42℃孵育0.5 h，倒去包被液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；（二）封闭用1× BSA‑PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200μL，37℃孵育2 h，倒去封闭液，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；（三）加待检样品相应孔加一定稀释倍数的标准品或待测样品100μL，阴性对照孔加100μL的1× BSA‑PBS，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；（四）加生物素标记的鼠抗赭曲霉毒素A单克隆抗体除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体100 μL ，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3 min/次，甩干；（五）加量子点标记的链霉亲和素所有相应孔加100 μL用TBS缓冲液1:100稀释的量子点标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，3min/次，甩干；（六）相对荧光强度检测在多功能荧光酶标仪上以390nm为激发波长，605nm为发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔的相对荧光强度，得到相对荧光强度值；（七）建立标准曲线并计算待测样品中的赭曲霉毒素A的浓度根据赭曲霉毒素A浓度和相应的相对荧光强度建立了标准曲线，在0.39 μg/L～125 μg/L之间，赭曲霉毒素A浓度与相对荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=0.0207x+0.196（线性相关系数R2=0.9938，y为相对荧光强度，x为赭曲霉毒素A的浓度（μg/L））；根据标准曲线回归方程可计算出样品的赭曲霉毒素A的浓度。