[发明专利]一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用

摘要

本发明提供一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用，该制备方法以雷公藤内酯醇为微生物代谢药物，通过特殊诱导子对微生物代谢雷公藤内酯醇，同时得到多种、高产率的基于雷公藤内酯醇的羟基和或甲基化修饰的雷公藤内酯醇衍生物，这些雷公藤内酯醇衍生物具有抑制肿瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用。本发明方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤内酯醇衍生物。

主权项

一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，即得种子孢子液；步骤二：以100ml土豆液体培养基中接种5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH值6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3％时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，即得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100％石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100％乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生物；所述方法可用于制备的雷公藤内酯醇衍生物如下：16‑羟基雷公藤内酯醇、15‑羟基雷公藤内酯醇、2β‑羟基雷公藤内酯醇、1β‑羟基雷公藤内酯醇、5α‑羟基雷公藤内酯醇、19α‑羟基雷公藤内酯醇、19β‑羟基雷公藤内酯醇、5α‑羟基‑14表雷公藤甲素、5β、6β–双羟基雷公藤内酯醇、5α、6α‑双羟基雷公藤内酯醇、和14‑甲基雷公藤内酯醇；所述的转化菌种为短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)AS3.970；所述的联合诱导子为茉莉酸甲酯、地塞米松和β‑环糊精。