[发明专利]一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，以样品DNA为模板，利用细菌16S-23SrDNAITS序列通用引物L1/L2进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，通过设计的一对鉴别花生青枯病菌的特异性引物W1/W2，进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如果出现374bp的特异条带，则确定所检测的病原菌为花生青枯病菌。本发明的花生青枯病菌巢式PCR检测方法，对病菌基因组DNA的检测灵敏度为10fg，且能克服生物学鉴定、酶联免疫技术和常规PCR等方法的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异的花生青枯病菌检测方法，可用于田间花生青枯病菌的早期诊断，对该病害的早期检测和及时防治具有十分重要的意义。

主权项

一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）、基因组DNA提取：采用CTAB法提取花生青枯病菌基因组DNA或发病植物组织DNA；步骤2）、第一轮PCR扩增：以步骤1）得到的DNA样品为模板，采用细菌16S‑23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2经PCR扩增得到第一轮PCR产物；L1序列为SEQ ID NO:1，L2序列为SEQ ID NO:2；PCR反应体系25μl：DNA模板 1μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶 0.5μl，10μ mol/L的L1引物1μl，10 μ mol/L的L2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；PCR扩增程序：95℃预变性4min，94℃变性1 min，60℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；步骤3）、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板，采用花生青枯病菌特异引物W1/W2经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；W1序列为SEQ ID NO:3，W2序列为SEQ ID NO:4；PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl，10μ mol/L的W1引物1μl，10 μ mol/L的W2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；步骤4）、PCR扩增产物检测：取5 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在110V 电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min，取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在374bp的特异条带，则确定所检测的病菌为花生青枯病菌；所述的PCR反应缓冲液中均含有Mg2+。