[发明专利]一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，所述方法为：将含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌预诱导培养，然后将稻曲菌孢子液与预诱导后的农杆菌菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液均匀涂布于表面铺有滤纸、PVDF膜或硝酸纤维素膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于20～24℃共培养36～48h，然后将共培养后的膜剪成小片并铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4～5d，获得含有潮霉素B基因的稻曲菌；本发明方法转化子时间缩短为4～5d，转化效率高达91.3%；稻曲菌转基因后代稳定，基因丢失率低，转化子稳定性达95%。

主权项

一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：（1）质粒转化农杆菌：将构巢曲霉启动子和标记基因重组到带有潮霉素B基因的质粒中获得重组质粒，然后用重组质粒转化农杆菌，获得含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌；（2）预诱导：将含有潮霉素B基因和标记基因的农杆菌接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃、150rpm、黑暗条件下培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，取培养液离心，将沉淀用改良AIM培养液洗涤后再用含有终浓度150～250μmol/L乙酰丁香酮的改良AIM培养液稀释至OD₆₀₀为0.1～0.3，在28℃、150rpm、黑暗条件下诱导培养至OD₆₀₀为0.3～0.5，获得预诱导后的农杆菌菌液；所述改良AIM培养液终浓度组成为：8～12mg/L CaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/L FeSO₄、400～600mg/L NH₄NO₃、体积浓度0.4～0.6%glycerol、30～50mmol/L MES、0.5～0.7g/L MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/L NaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/L ZnSO₄·7H₂O、50～150mg/LCuSO₄·5H₂O、50～150m g/L H₃BO₃，50～150m g/L Na₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/L CoCl₂·6H₂O，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH4.8；（3）共培养：将稻曲菌接种在PSA液体培养基中，24～28℃培养至OD₆₀₀为0.7～1.0，将培养液用纱布过滤，滤液离心，沉淀加入PSA液体培养基，获得稻曲菌孢子液，然后将稻曲菌孢子液与步骤（2）获得的预诱导后的农杆菌菌液以体积比1：1混合制成混合菌液，将混合菌液均匀涂布于表面铺有滤纸、PVDF膜或硝酸纤维素膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基平板上，黑暗条件下于20～24℃共培养36～48h，再将共培养后的滤纸、PVDF膜或硝酸纤维素膜剪成小片并铺在改良的选择培养基CM上26℃培养4～5d，获得含有潮霉素B基因的稻曲菌；所述含乙酰丁香酮的改良AIM固体培养基终浓度组成为：8～12mg/LCaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/L FeSO₄、400～600mg/L NH₄NO₃、体积浓度0.4～0.6%glycerol、30～50mmol/L MES、0.5～0.7g/L MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/L NaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/L ZnSO₄·7H₂O、50～150mg/L CuSO₄·5H₂O、50～150mg/L H₃BO₃，50～150mg/L Na₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/L CoCl₂·6H₂O、150～250μmol/L乙酰丁香酮和13～18g/L琼脂，溶剂为0.01M磷酸缓冲液，pH7.0；所述选择性固体培养基CM终浓度组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素，溶剂为水，pH7.0。