[发明专利]一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法

摘要

本发明涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品技术领域，所述方法包括：1）种细胞的制备，2）生物反应器的准备，3）PK-15细胞悬浮培养，4）PK-15细胞悬浮培养病毒，5）细胞悬浮病毒培养及连续收获，6）病毒液培养周期及收获量。本发明逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型（PCV2）病毒液的工艺。

主权项

一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：1）使用转瓶培养制备密度为2～3×105个/mL的PK‑15细胞液；2）于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中：每接种1L的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4～5L；3）接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85～100转/分，溶氧为40～50%，pH为7～7.2，温度为36.8～37.3℃；4）所述PK‑15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型（PCV2），病毒接种量为生物反应器培养基8%（V/V），并同时加入终浓度为2mmol/L的D‑氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90～100转/分，溶氧为50～55%，pH为7.2～7.4，温度为36.4～36.8℃；5）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4）相同，其中：所述步骤2）中每接种1L的所述细胞液，每天加流灌注量为15L；6）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种后240～360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型（PCV2）病毒液。