[发明专利]弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌细胞生长和转移的影响研究方法

摘要

本发明涉及一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，具体包括以下步骤：(1)MTT法检测细胞的增殖；(2)A549细胞克隆形成能力检测；(3)Hochest33342／PI双染法检测细胞凋亡；(4)单层细胞迁移实验(wound healing)；(5)Transwell侵袭实验；(6)Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平；(7)酶联免疫吸附试验；(8)统计分析。本发明通过研究弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响，可以更好地利用Furin抑制剂a1-PDX抑制Furin在肺腺癌A549细胞中表达，从而有效地为癌症治疗提供依据。

主权项

一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)MTT法检测细胞的增殖：对数生长期A549细胞接种到96孔板中(每孔5×103)，24h后开始加入不同浓度的a1‑PDX(200nM、400nM)继续培养24h‑96h；每孔加入20μl MTT试剂(5毫克／毫升)溶液，并于37℃温育4小时；每孔加入150μL的DMSO溶解甲臜晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度；(2)A549细胞克隆形成能力检测：取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10％胎牛血清的1640培养液中，以1×103／ml的细胞密度接种于培养皿中；加入不同浓度的a1‑PDX(200nM、400nM)置37℃、5％CO2的饱和湿度环境下，静置培养2周；弃去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min；去除固定液，吉姆萨染液染色10min，流水缓慢冲洗后空气干燥后，肉眼直接计数克隆并统计分析；(3)Hochest33342／PI双染法检测细胞凋亡：对数生长期细胞A549按1×104个／ml浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上；不同浓度的a1‑PDX处理48h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hoechst33342／PI染液浓度至终浓度5μg／ml，37℃避光染色15min；弃去染液，加入4％多聚甲醛4℃固定5min；在荧光显微镜下观察拍摄；(4)单层细胞迁移实验(wound healing)：A549细胞接种在6孔板，待生长至汇合度达100％时，用无菌的200μl的Tip头尖制成划痕(wound)，并用PBS洗涤细胞碎片；在指定的时间用倒置显微镜配备的数码相机拍摄受伤区域的细胞迁移情况；(5)Transwell侵袭实验：不同浓度a1‑PDX处理的A549细胞(1×105)接种于Transwell小室的上部腔室，含有200μl的RPMIl640培养基，但不含10％FBS；Transwell小室下部腔室被填充有500μl的完整的RPMIl640培养基，含10％FBS；使细胞迁移48小时，然后用4％甲醛将细胞固定，室温下孵育15分钟；去离子水洗涤后，0.1％结晶紫染色；在光学显微镜下拍摄迁移的克隆；(6)Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平：收集细胞加入RIPA缓冲液(50mM的Tris pH7.4，150mM氯化钠，1％的Triten X‑100，0.1％SDS，1％脱氧胆酸钠，5mMEDTA，l00mM的氟化钠)及蛋白酶抑制剂，冰上孵育30分钟，13200rpm离心30min；收集上清并BCA法(Pierce，USA)测定蛋白浓度；细胞总蛋白经12％SDS‑PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜，室温下5％脱脂牛奶封闭1h；在4℃下孵育MT1‑MMP、VEGF‑C、VEGF‑D和GAPDH(1：1000)的抗体过夜；PBST洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温下孵育1h，PBST洗涤后，超敏发光液孵育后采用LAS3000成像仪拍照；(7)酶联免疫吸附试验：A549细胞处理同前所述，收集细胞培养上清并根据MMP‑9、MMP‑2、VEGF‑c ELISA检测试剂盒说明书进行后续的检测；每个样品重复5次；(8)统计分析：应用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料采用配对t检验及单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，P＜0.05具有统计学意义。