[发明专利]一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法

摘要

本发明公开了一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法，采用了主要加入不同植物生长调节剂的1/2MS液体培养基进行不定芽诱导的技术特征，建立了大马士革玫瑰固体-液体-固体培养体系，愈伤组织诱导率为100%，不定芽分化率为90.9%，生根率为100%，移栽成活率为100%。本发明方法可以减轻大马士革玫瑰愈伤组织褐化程度，降低在培养过程中发生变异的几率，简单易行，解决了大马士革玫瑰组织培养过程中再生率比较低的问题，效率高，为大马士革玫瑰的组织培养和高频离体再生体系的建立提供了重要的技术基础。

主权项

一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法，其特征在于，按以下步骤进行：（1）外植体的获得取长出14天的幼嫩叶片在自来水下冲洗干净，接着用浓度为75%的酒精表面消毒30s～40s，再在浓度为0.1%的升汞溶液中灭菌2min～6min，用无菌水漂洗3～5次，最后在无菌条件下将叶片剪成四周有伤口﹑且尺寸为1cm×1cm的叶片；（2）愈伤组织的诱导将剪切好的叶片接种在诱导愈伤组织培养基上，在温度为25℃±2℃、光照培养条件为500Lx～2000Lx的条件下培养，3周后将愈伤组织转到新鲜的诱导愈伤组织培养基上继代培养，每2周继代一次；所述的诱导愈伤组织培养基的组成为：以MS培养基为基础，加入30g·L‑1的蔗糖，0.7%的琼脂，2mg·L‑1的谷氨酰胺，（3～5）mg·L‑1的2，4‑D，（0.1～1）mg·L‑1的6‑BA，10mg·L‑1的AgNO3，pH调为5.8‑6.2；（3）单细胞分散称取1g新鲜疏松的愈伤组织，加入浓度为0.1%的果胶酶，黑暗中25℃中静置12h～16h，再用电磁搅拌器低速搅动几分钟，即获得细胞悬液，然后用血球计数板进行计数，参照所测得的单位愈伤组织的细胞数目，称取适量的愈伤组织，放入液体培养基的三角瓶中，在50rpm，25℃±2℃连续振荡培养3周后，用100目的尼龙网过滤，可获得95%的单细胞；滤液用1500rpm的速度离心5min，离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，形成细胞悬液；（4）细胞悬浮培养诱导不定芽将细胞悬液倒入三角瓶中，根据需要的起始密度，补定量的新鲜的液体1/2MS分化培养液，三角瓶含有40ml的液体1/2MS分化培养液，摇床为 50rpm，在温度为25℃±2℃、光照强度为1000‑2500Lx条件下，每天光照16h，进行诱导不定芽的形成；所述的液体1/2MS分化培养液的组成为：以液体1/2MS培养基为基础，加入（1.5‑3）mg·L‑1的TDZ，（0.05‑0.5）mg·L‑1的NAA，（0.1‑1.0）mg·L‑1的6‑BA，10mg·L‑1的AgNO3，（0.1‑0.3）mg·L‑1的水解酪蛋白，pH调至5.8‑6.2；接种密度为105个/L，每11d继代一次，筛选在液体1/2MS分化培养基中继代2～3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中继续培养，2‑3周形成不定芽，该1/2MS固体分化培养基成分为：以1/2MS培养基为基础，附加1.0mg·L‑16‑BA，0.5mg·L‑1NAA，0.7%的琼脂，质量分数为3%的蔗糖，pH调至5.8‑6.2；（5）苗的生根待芽长至2‑3cm，将诱导得到的芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所述的诱导生根培养基的组成为：以1/4MS培养基为基础，加入0.5mg·L‑1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的琼脂，0.1%～0.3%的活性炭；培养温度为25℃±2℃、光强为2000lx、光照16h/天，培养2‑3周后即获得大量组培苗。