[发明专利]一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，通过副溶血性弧菌阳性标本制备、副溶血性弧菌浓缩富集、副溶血性弧菌核酸提取、引物设计、模板制备、基因扩增和PCR产物分析等步骤完成。本发明实现了水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌鉴定方法，这种方法省时，省力，检测灵敏度高，能够很好满足人们对水产养殖鱼类等日益严格的质量要求，并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。

主权项

一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，检测步骤包括：（1）副溶血性弧菌阳性标本制备：取300～800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入1m³，含10条15～20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；（2）副溶血性弧菌浓缩富集：分别取阳性标本和待测样本各4～5条，阳性标本和待测样本分别取20～100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2～4℃下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2～4℃静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；（3）副溶血性弧菌核酸提取：将步骤（2）中5～10ml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取DNA；（4）引物设计：上游引物AGACAACTATGATGCAGATTA  下游引物TGATCATCACGATAGAAATAG；（5）模板制备：将步骤（3）中获得的提取液在‑4℃下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15～30分钟；（6）基因扩增：将步骤（5）中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增；（7）PCR产物分析：将步骤（6）中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。