[发明专利]用反向载体法构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻

摘要

本发明构建的工程鱼腥藻，用基因操作调控蓝藻中pepc基因的表达包括目的基因的钓出和载体的构建，蓝藻的转化和转化子筛选，工程蓝藻的培养和检测，总脂及脂肪酸含量测定。结果证明，与野生型相比，pepc基因反向表达的鱼腥藻含脂率提高了93%，总脂从野生型的11.5%提高到22.2%，脂产率增加了一倍，已达到真核藻的平均含脂水平。因此，本发明构建的pepc基因反向表达的鱼腥藻可作为制备生物柴油和必需脂肪酸较理想的原料。

主权项

构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程鱼腥藻7120转化子的方法，其特征在于，用反向载体法调控pepc基因在丝状体鱼腥藻7120的表达，步骤包括：(a)以鱼腥藻7120的基因组为模板钓取pepc基因；用PCR法扩增获得pepc基因，所述的pepc基因序列如SEQ ID No.1所示；所用的引物序列为：上游5’‑GATGGGCAAGCCACAAAAGACC‑3’；下游5’‑AGGATCCGCGGGACGAGAAC‑3’；(b)pepc基因与pRL‑489质粒连接，构建反向穿梭表达载体并转入大肠杆菌；(c)将含有辅助质粒和接合质粒的大肠杆菌、步骤(b)获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型鱼腥藻7120培养到对数生长中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的细胞数量比混合，通过三亲接合转移法用带pepc基因的载体转化鱼腥藻7120；(d)用含抗生素的无氮BG11培养基或培养液筛选鱼腥藻7120转化子；所述抗生素为卡那霉素或硫酸新霉素，所述的筛选鱼腥藻7120转化子的方法为：(1)将混合后的细胞均匀涂在滤膜上，在无抗生素的BG11培养基上培养6～8天直至能看到藻株生长；(2)然后在含抗生素浓度为15～30μg/mL的BG11培养基上培养18～24天筛选出对抗生素有抗性的鱼腥藻7120转化子单藻落；(3)挑选生长较好的鱼腥藻7120转化子单藻落，置于抗生素浓度20～50μg/mL的培养液中培养5‑8天；(4)再经过2～4次逐级提高抗生素浓度的筛选培养，每次培养时间为5～8天，直至抗生素浓度提高到280～300μg/mL；(5)用PCR技术检测工程鱼腥藻7120转化子中的pepc基因，并用RT‑qPCR法检测鱼腥藻7120转化子中pepc基因表达。