[发明专利]新型杂合几丁质酶的创制在审
| 申请号： | 201310662769.5 | 申请日： | 2013-12-10 |
| 公开（公告）号： | CN104178473A | 公开（公告）日： | 2014-12-03 |
| 发明（设计）人： | 钟万芳;郭慧芳;刘宝生 | 申请（专利权）人： | 江苏省农业科学院 |
| 主分类号： | C12N9/42 | 分类号： | C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70 |
| 代理公司： | 无 | 代理人： | 无 |
| 地址： | 210014 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种获得产量提高、活性增强的杂合几丁质酶的方法。根据几丁质酶基因的全长序列设计引物，定向克隆到pET-30a载体获得pETChiA，然后在几丁质酶羧基端插入几丁质结合域或者催化域，重组成表达载体；将表达载体转化至大肠杆菌，诱导表达，用Tris缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；通过HIS镍柱收集获得含有重组几丁质酶的溶液，产品纯度高，产量高，活性高，成本低，生产工艺简单，产品质量稳定。 | ||
| 搜索关键词： | 新型 几丁质 创制 | ||
【主权项】：
新型杂合几丁质酶的创制，其特征是包括以下步骤：(1)根据几丁质酶基因Chi的全长序列设计引物，在引物5’端增加酶切位点，将几丁质酶基因序列定向克隆进入pET30a载体；然后在几丁质酶的羧基端插入几丁质结合域。这样即重组成表达载体pET‑30a‑Chi‑ChBD，相应表达产物为Chi‑ChBD。(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET‑30a‑Chi‑ChBD转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导重组基因的表达，离心收集菌体。(3)用Tris缓冲液重悬达到的菌体，超声破碎，离心收集上清液，得到含有重组几丁质酶的溶液。(4)将含有重组几丁质酶的溶液上HIS镍离子亲和柱，用Tris缓冲液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM洗脱目的蛋白，透析过夜，得到含有重组几丁质酶的纯化品。
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