[发明专利]一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法

摘要

一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法，属于生物活性肽的制备纯化领域，本发明从真实细菌中提取细胞膜脂，并利用该膜脂在离体条件下组装模拟细胞膜。蛋白双酶水解后制备含抗菌肽的组分，采用模拟细胞膜亲和固定相吸附结合高效液相-质谱技术快速筛选、鉴定及分离纯化蛋白水解源抗菌肽；本发明的分离纯化方法采用细菌膜脂构建模拟细胞膜，并用此膜亲和吸附抗菌肽，整个分离过程仅涉及亲和吸附和RP-HPLC两个步骤，同传统的多步色谱分离抗菌肽的方法相比，具有操作简单，快速高效的优点，同时克服了真实细胞膜色谱中细胞膜易失活的缺点。本发明方法的建立为快速、高通量筛选新型、高纯抗菌肽提供了一条方便快捷的途径。

主权项

一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法，其特征在于以细菌膜脂构建模拟细胞膜亲和固定相，再将蛋白进行双酶复合酶解，最后采用模拟细胞膜亲和吸附及高效液相色谱‑质谱技术快速筛选鉴定抗菌肽，具体工艺如下：(1)将经三代试管斜面活化培养的细菌转接入液体培养基中培养至对数期，离心弃培养基取得菌体，无菌水清洗菌体数次以除去残留培养基；(2)将步骤(2)中得到的菌体，重悬于Tris‑HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，向此菌悬液中加入氯仿‑甲醇(1∶2，V／V)混合溶液，室温下搅拌60～90min后，依次加入等体积氯仿和无菌水，继续搅拌20min～30min，收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮气除去残留溶剂，得到细菌细胞膜脂；(3)硅胶在20％HCl中回流6～10h，用去离子水洗至中性，110～120℃干燥，制得活化硅胶；(4)将步骤(2)中得到的细菌细胞膜脂溶于氯仿／甲醇(19∶1，v／v)中，将步骤(3)中得到的活化硅胶加入到上述溶液中，4℃振摇30～60min，旋转蒸发除去溶剂，通氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜，将其用pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液溶胀6h～10h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体，上清液离心去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，离心沉降物即为细菌膜脂源模拟细胞膜亲和固定相；(5)将蛋白以两种蛋白酶进行复合酶解，控制料液比1∶8～1∶20，37～60℃下调节pH2.0～9.0，酶解结束后，调回pH到6.8～7.0，100℃煮沸灭酶10min，随后将其快速冷却至室温；(6)将步骤(5)中所得蛋白酶解液进行离心操作，离心条件为：温度4～25℃，时间10～15min，转速8000～12000r，离心结束后，取上清液，经100Da透析袋透析，再将其置于预冷温度为‑86℃超低温冰箱中预冻，预冻时间为2～6h，随后进行真空冷冻干燥，设置参数为‑55～‑45℃，压力0.03～0.2mBar，冻干时间为48～72h，冻干粉配成等浓度溶液进行抗菌试验，取抗菌能力最好的组分‑20℃保存留用；(7)将步骤(4)中得到模拟细胞膜亲和固定相和抗菌能力最强的蛋白酶解物组分混合置于2～50ml离心管中，25～37℃下保温孵育30～120min，离心后留取上清液，沉淀用缓冲液淋洗6～10次，保留洗涤液，合并洗涤液和上清液，并命名为模拟细胞膜吸附后流出液，利用高效液相‑质谱技术检测抗菌能力最强的蛋白酶解物组分和模拟细胞膜吸附后流出液的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积减小的差异峰，并对其进行抗菌能力验证和肽序分析，制备得到的差异峰即为抗菌肽。