[发明专利]一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用

摘要

本发明公开了一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。本发明公开的一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列。本发明利用甲醇诱导的毒性蛋白mazF对mRNA的切割作用，达到无标记或无痕敲除的目的，为多形汉逊酵母遗传操作提供了极大便利。

主权项

一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列；抗性筛选标记基因表达盒是用于筛选重组多形汉逊酵母菌的；mazF表达盒能够在重组多形汉逊酵母菌中表达mazF蛋白；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A为抗性基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的5’末端开始至抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基处结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段B为抗性筛选标记基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基开始至抗性筛选标记基因表达盒3’末端结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的3’端与抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的5’端有部分重叠序列，该部分重叠序列供DNA片段甲和DNA片段乙发生同源重组从而在汉逊酵母细胞内形成完整的抗性筛选标记基因表达盒；mazF表达盒中的启动子是甲醇诱导的MOXp启动子；mazF的氨基酸序列是如SEQ ID No.2所示；m和n为如下中的任一种：（1）m为CYC1TT序列，n为CYC1TT序列；CYC1TT的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示；（2）m为空白序列，n为目的基因5’端上游序列；（3）m为目的基因3’端下游序列，n为空白序列；（4）m为空白序列，n为目的基因5’端序列；（5）m为目的基因3’端序列，n为空白序列。