[发明专利]一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法。本发明设计了ZYC349/ZYC350，ZYC357/ZYC358，ZYC412/ZYC415，ZYC479/ZYC4804对特异性引物，这些引物可用于扩增含有外源绿色荧光蛋白基因，驱动其翻译的柑桔衰退病毒p23基因启动子，进而通过双酶切将连接后的片段插入柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148中p23基因的末端，从而使得柑桔衰退病毒能够作为表达载体在本生烟中稳定、高效的表达绿色荧光蛋白基因达2个月以上。本发明为研究柑桔衰退病毒在植株中的分布、移动，以及将其作为生物反应器大量表达优质蛋白提供了极其重要的技术平台。

主权项

一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，包括以下步骤： 1）提取病株中柑桔衰退病毒的总RNA； 2）以上述总RNA为模板，用引物ZYC357/ZYC358扩增启动子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别扩增柑桔衰退病毒基因组的片段1和片段2，所述的引物核苷酸序列分别为： ZYC357：5’‑TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT‑3’ ZYC358：5’‑ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A‑3’ ZYC412：5’‑GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG‑3’ ZYC415：5’‑CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA‑3’ ZYC479：5’‑CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG‑3’ ZYC480：5’‑ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC‑3’ 3）用含有绿色荧光蛋白的质粒和特异引物ZYC349/ZYC350扩增绿色荧光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列为： ZYC349：5’‑AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA‑3’ ZYC350：5’‑AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA‑3’ 4）将步骤2、3中获得的启动子、片段1、片段2和绿色荧光蛋白基因的扩 增产物经切胶纯化后，分别与载体进行链接、转化，并对获得的菌液进行质粒纯化； 5）取步骤4中的纯化后分别含启动子和片段2的质粒混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC358，从而得到35S‑127，并进行浓缩；将纯化后分别含片段1和绿色荧光蛋白基因的质粒进行混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC349/415，从而得到35S‑126；将浓缩后的35S‑126和35S‑127混合，再次通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC415，从而得到35S‑128，并进行浓缩； 6）取步骤5中所述浓缩后的35S‑128与柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S‑148分别进行StuI/PacI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收，纯化后的酶切产物混合并进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后从而得到柑桔衰退病毒的表达载体35S‑149。