[发明专利]一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明针对柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列，设计了6对特异性引物，这些引物的扩增区域涵盖了FS-577的全序列。将扩增片段经双酶切后依次插入到改造后的双元载体pUC119-Δ9后获得的全长侵染性克隆与野生型FS-577相比，在序列、侵染能力和寄主范围等性状上完全一致。利用该方法建立的试剂盒，包括有第一链cDNA合成、PCR扩增、双酶切缓冲液，以及链接反应缓冲液等，这些试剂盒可用于构建柑桔衰退病毒全长侵染性克隆。本发明为研究柑桔衰退病毒致病和蚜传等机理，以及柑桔衰退病防治提供了极其重要的技术平台。

主权项

一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤： 1）提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS‑577的总RNA； 2）以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA； 3）用柑桔衰退病毒分离株FS‑577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段：cDNA片段1～6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为： 引物1上游引物序列ZYC214： 5’‑CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC‑3’； 引物1下游引物序列ZYC1293： 5’‑GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC‑3’； 引物2上游引物序列ZYC749： 5’‑AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC‑3’； 引物2下游引物序列ZYC1894： 5’‑GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG‑3’； 引物3上游引物序列ZYC253： 5’‑GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT‑3’； 引物3下游引物序列ZYC1436： 5’‑AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT‑3’； 引物4上游引物序列ZYC126：5’‑CTTACTACGCCAACGCGAGCC‑3’； 引物4下游引物序列ZYC1493： 5’‑GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT‑3’； 引物5上游引物序列ZYC431： 5’‑GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA‑3’； 引物5下游引物序列ZYC1478： 5’‑GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA‑3’； 引物6上游引物序列ZYC2158： 5’‑CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG‑3’； 引物6下游引物序列ZYC114：5’‑CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT‑3’； 4）将步骤3中扩增得到的cDNA片段1与双元载体pUC119‑Δ9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S‑143；将35S‑143与cDNA片段2分别进行PstI/SwaI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S‑144；将35S‑144与cDNA片段3分别进行XmaI/PmeI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S‑145；将35S‑145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S‑146；将35S‑146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S‑147；将35S‑147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S‑148。