[发明专利]一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法

摘要

本发明公开的一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，其包括如下步骤：（1）混合DNA的制备步骤；（2）特异引物的合成步骤；（3）特异引物扩增步骤；（4）测序引物插入步骤；（5）按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。通过生物信息分析，发现得到的突变体密度是平均每17个碱基就有一个转座子插入，插入密度可以覆盖整个基因组中所有编码基因，由此证明利用本发明的方法可以非常快速有效的在全基因组层面鉴定基因功能。

主权项

一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，包括如下步骤：（1）混合DNA的制备步骤用病原微生物菌株作为载体，利用Tn转座子可以随机插入微生物基因组的特性，培养一批不同插入密度的细菌突变体菌体，在达到一定生长曲线后，将所有突变菌株DNA释放出来，这时，释放的DNA为各种不同突变菌株的混合DNA；（2）特异引物的合成步骤将步骤（1）得到的混合DNA进行片段化处理，所述片段化处理是取长度在300‑800bp的末端突出的DNA片段；然后将所有片段化DNA连接一DNA粘端接头，该DNA粘端接头的5’端为Y型分叉，其序列式分别为：5‑ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTAC*T‑3；5‑GTAGGGAAGAGCTCGTATGCCCTCTTCTGATTG‑3；在DNA片段两端分别连接上不同的DNA粘端接头后，合成特异引物，该特异引物含有与DNA粘端接头退火的5‘端，又含有Tn转座子插入基因组DNA的最旁界的序列的3’端，其序列式为：5‑ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTACTGTTACCAGGTCACAACCAAT‑3（3）特异引物扩增步骤用步骤（2）制备的特异引物与DNA粘端接头的3‘端引物序列进行PCR扩增，富集出来的DNA片段是含有转座子插入基因组的边界序列和基因组DNA序列；（4）测序引物插入步骤将测序引物位于Tn插入基因组边界的13个bp，这样测序得到的序列是转座子边界13bp序列和插入基因组DNA的所有序列信息；（5）按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。