[发明专利]基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法

摘要

本发明公开一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法。该方法包括如下步骤：三联吡啶钌的合成与活化、聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备、DNA探针标记聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物和磁捕捉检测目标DNA序列；本发明是将基于聚合物电化学发光信号放大技术运用于核酸检测，有机多聚物（如聚赖氨酸）具有较好的物理及化学性质，可运用到电化学发光信号放大领域；本发明采用聚赖氨酸作为三联吡啶钌信号放大的连接骨架，体系稳定，不易发生聚集且容易保存；DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物性质稳定，便于修饰及储存。该方法操作简单、快速、稳定、可控，不仅适用于核酸检测，也可作为免疫分析中抗体标记的方法，以提高灵敏度。

主权项

一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于包括以下具体步骤：（1）三联吡啶钌的合成：①称取：二氯双(2,2'‑联吡啶)钌0.05g，NaHCO30.05g，4‑羧酸‑2,2'‑联吡啶0.0375g；②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液，混合液在硅油浴下回流；③所得溶液在冰浴中冷却2h；④用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4，形成沉淀；⑤形成的沉淀进行过滤，收集滤液；⑥向⑤中所得滤液中加入3.125mL NaPF6溶液，搅拌后置于4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；收集所得结晶即为二（2,2'‑联吡啶）（4‑羧酸‑2,2'‑联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐）；（2）三联吡啶钌的活化：①称取：二环己基碳二亚胺1.1635g，N‑羟基琥珀酰亚胺0.5947g；②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺中，然后冰浴冷却1h；③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'‑联吡啶）（4‑羧酸‑2,2'‑联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀；④室温下密封振荡；⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联吡啶钌；（3）聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物的制备：①取一管聚赖氨酸固体粉末离心；②打开管盖，并加入75μL0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，盖上管盖；③充分上下振荡5min，离心收集；④加入30μL的步骤（2）⑤中所得到的活化三联吡啶钌；⑤室温避光孵育12h；⑥用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；⑦离心，倒去滤液，加入0.5mL预冷无水乙醇，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；⑧离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温 冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；⑨离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；⑩离心，将所得沉淀，加100μL水稀释，得到聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物，放入‑20℃保存；（4）DNA探针标记聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物：该反应体系中，将聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物、DNA探针及1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺混匀，调整pH值至6；避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的聚赖氨酸‑三联吡啶钌复合物，并用纯水保存在‑20℃；（5）磁捕捉检测目标DNA序列：以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸‑三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法；（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM；（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及聚赖氨酸的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×，加水补充至100μL；（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入分析仪中检测电化学发光信号。