[发明专利]一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法

摘要

本发明公开一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS-PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，将不同浓度的黄芩苷和黄芩素加入到含有金黄色葡萄球菌的培养基中，分别测定其总蛋白浓度，SDS-PAGE电泳进行分析，测定其溶血毒素的表达。

主权项

一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS‑PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，其特征在于，具体步骤如下，（1）药物干预作用，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种至3ml含0.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，35~37℃、250rpm/min培养12h后，接种到300mlTSB液体培养基中放大培养，培养至OD₆₀₀=0.3分成N份，分别加入黄芩苷和黄芩素，加入黄芩苷的浓度为0~1/2MIC，加入黄芩素的浓度为0~1/2MIC，置于35~37℃、250rpm/min培养5h后取样，12000rpm/min离心5min，分离菌体和上清液，上清液用0.22μm滤膜过滤，备用；（2）试剂配制，配制10%过硫酸铵、12%的分离胶、浓缩胶、封闭液和显影定影液；（3）测量总蛋白浓度，取10μl 5mg/ml牛血清白蛋白用TSB液体培养基稀释至100μl，后按0、1、2、4、8、12、16、20μl分别加到96孔板，加入TSB液体培养基将体积补足至20μl，再取20μl步骤（1）获得的上清液，加入到上述各孔中，后各孔加入200μlBradford染色液，震荡混匀5min用酶标仪测定A₅₉₅，根据标准品测得数值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出上清液的总蛋白浓度；（4）SDS‑PAGE电泳，包括制备凝胶、电泳上样、转膜、封闭、孵育抗体、发光显影定影和凝胶图像分析；（5）测定溶血毒素的表达，1）引物设计，包括上游引物和下游引物；2）提取RNA，将步骤（1）获得菌体加入0.5mlDEPC水漂洗，10000rpm/min转离心1min，取上清液加入60μl 10mg/ml溶菌酶、5μl溶葡萄菌酶及TE buffer后震荡重悬细菌，置于35~37℃、40min裂解菌壁后， 4℃、12000rpm/min离心3min，得沉淀液；加入1mlTrizol均质化5min，再加入200μl氯仿摇15s，混匀放置3min后，4℃、12000rpm/min离心15min；将上层水相移至新的EP管中，加入480μl异丙醇，混匀后置于‑20℃ 20min，4℃、12000rpm/min离心15min得沉淀，弃上清液；EP管加入1ml75%酒精，摇晃使沉淀溶解，4℃、12000rpm/min离心10min得沉淀，室温晾干；加入RNase‑free水溶解，测RNA浓度；3）RNA逆转录，以2μg步骤2）获得的RNA为模板，具体过程及反应体系如下：试剂 用量RNA xμlOligo（dT）₁₈ 1μlDEPC水补至 12μl第一步反应体系为12μl，反应条件为65℃ 5min，4℃ 5min；试剂 用量40mg/L 5×反应缓冲液 4μl20U/μl RNA酶抑制剂 1μl10mMdNTP Mix 2μl200U/μl逆转录酶 1μl第一步欲结合完成后加入上述试剂，使得反转录体系总体积为20μl，第二步反应条件为42℃60min，70℃5min，最后降至4℃；即cDNA；4）普通PCR验证，以cDNA为模板，进行普通PCR扩增，反应条件为95℃预热5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，一共35个循环，最后72℃温育5min，取10μlPCR扩增产物，加至已加入Ⅰ型核酸染料的2%琼脂糖凝胶加样孔中，在TBE缓冲液中电压为100V进行电泳25min，凝胶成像系统下观察结果并拍照；普通PCR的反应体系如下： 2×Taq PCR Master Mix 12.5μl灭菌去离子水 9.5μl上游引物 1μl下游引物 1μlcDNA 1μl总计 25μl5）mRNA水平定量检测，荧光定量PCR试剂盒进行反应液配制，反应液配制在冰上进行，实时定量PCR仪进行扩增反应，荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，58℃退火60s，40个循环，在每个循环延伸阶段读取荧光信号，最后生成扩增曲线、产物溶解曲线；反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5μl灭菌去离子水 9.5μl上游引物 1μl下游引物 1μlcDNA 1μl总计 25μl。