[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法

摘要

本发明提供一种利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法，先将编码Cas9和OCT1蛋白的基因表达于真核细胞系中，筛选获得稳定表达Cas9的细胞系，再进行文库构建和功能筛选。其最大的优点在于：可将此方法应用于绝大多数真核细胞系中，不受特定细胞系的限制。另外，进行功能性筛选阳性率高，背景值低。大规模的筛选方法极大降低了成本，克服了单个制备基因敲除细胞，所导致的时间和劳动成本高的问题。

主权项

一种利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建稳定表达OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系：将编码蛋白OCT1和Cas9的DNA序列通过柔性Linker连接，然后克隆至慢病毒载体pOCT1‑2A‑Cas9‑IRES‑BSD上；用构建好的载体转染真核宿主细胞；筛选稳定表达OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系；其中，载体pOCT1‑2A‑Cas9‑IRES‑BSD的序列如SEQ ID No.1所示；2）sgRNA质粒文库的构建：i.根据sgRNA作用位点的DNA序列5’‑G‑Nx‑NGG‑3’，其中19≤x≤22，设计并合成针对上述作用位点的sgRNA单体，针对同一个sgRNA作用位点设计两个sgRNA单体，其序列分别为正向单体：5’‑ACCG‑Nx‑3’，反向单体：5’‑AAAC‑N’x‑3’，其中N’x为Nx的反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C；ii.将上述合成的针对同一个sgRNA作用位点的两个sgRNA单体退火形成具有粘性末端的双链DNA，并将针对所有基因合成的sgRNA单体经退火形成的双链DNA等量混合；iii.将人U6启动子连接ccdB序列以及序列5’‑G‑Nx‑NGG‑3’之后，连入PLL3.7载体中替换原载体上的U6启动子，将构建好的载体与ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性内切酶和T4连接酶，37℃ 5min，16℃ 5min，重复10个循环；iv.将上述产物转化至Trans1‑T1感受态细胞中，提取质粒，即构建得到sgRNA质粒文库；3）将上述质粒文库中的质粒与质粒psPAX2和PMD2.G共转染至HEK293T细胞中，培养细胞，收获病毒液；4）用收获的病毒液按MOI=0.05接种步骤1）中构建得到的真核细胞系，细胞经培养后，使用流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞，即获得真核基因敲除的细胞文库。