[发明专利]定量多重甲基化特异性PCR方法-cMethDNA、试剂及其用途

摘要

本发明的cMethDNA方法是QM‑MSP方法(美国专利号8,062,849)的新颖的改进，特别地旨在以已经报道的最低拷贝数定量检测流体诸如血清或血浆中的肿瘤DNA(或其他循环DNA)。与任何其他基于PCR的测定相比特有的是，将少量拷贝的合成的多核苷酸标准品(STD基因)添加至等分的患者血清。在标准过程中，将用于多个感兴趣的基因(TARGET基因)的标准品的混合物添加至血清样品。纯化并处理总DNA后，进行PCR(多重步骤)，其中用相同的外部引物组共扩增STD基因和TARGET基因。在第二巢式PCR步骤中，存在于第一PCR反应的稀释物中的扩增子经受实时PCR，并通过双色实时PCR对一个孔中的各基因进行定量。产物通过用对甲基化的TARGET基因和相关的STD基因特异性的内部引物组的绝对定量来计算。公开了制备STD基因标准品的方法及cMethDNA方法的用途以及包含其的试剂盒。

主权项

对待检测的各感兴趣的TARGET基因特异性的STD基因在制备用于定量来自受试者的样品中一个或更多个感兴趣的TARGET基因的甲基化的试剂盒中的用途，所述STD基因由与所述TARGET基因具有相同的核苷酸数目的DNA序列组成，所述STD基因的5’和3’末端的20‑22bp的DNA序列与所述TARGET基因的那些5’和3’末端的20‑22bp的DNA序列在序列上相同；且其中所述STD基因的5’末端的20‑22bp DNA序列和3’末端的20‑22bp DNA序列之间的间隔DNA序列缺乏与TARGET基因的序列的同源性且与所述TARGET基因的序列完全无关，当所述试剂盒被使用时包括以下步骤：a)向来自所述受试者的包含DNA的所述样品中添加所述对待检测的各感兴趣的TARGET基因特异性的STD基因的多个拷贝；b)分离并处理所述样品中的DNA；c)制备(a)中的DNA用于甲基化特异性PCR；d)使用PCR在足以产生第一扩增产物的条件下用一对或更多对外部甲基化不依赖的PCR引物扩增(b)中的DNA，其中各单一引物对能够仅与一个待检测的感兴趣的TARGET基因和对该TARGET基因特异性的STD基因选择性地杂交；e)获得(d)的第一扩增产物的稀释的样品；f)向(e)中添加对各感兴趣的TARGET基因特异性的一对内部甲基化依赖的PCR引物、对所述感兴趣的TARGET基因的STD基因特异性的一对内部PCR引物、与各感兴趣的TARGET基因特异性杂交的一个或更多个光学可检测的标记的DNA探针和与所述感兴趣的TARGET基因的各STD基因特异性杂交的一个或更多个光学可检测的标记的DNA探针；以及g)在足以产生第二扩增产物的条件下使用定量RT‑PCR扩增(f)中的DNA，所述第二扩增产物提供甲基化的感兴趣的TARGET基因的拷贝的量和所述感兴趣的TARGET基因的STD基因的拷贝的量的定量。