[发明专利]用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化

摘要

本发明提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物。提供了多种载体和载体系统、以及用于设计和使用此类载体的方法，其中一些载体和载体系统编码CRISPR复合物的一个或多个组分。还提供了指导CRISPR复合物在真核细胞中形成的方法以及用于通过利用CRISPR‑Cas系统引入精确突变来筛选特异性细胞的方法。

主权项

一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：A)一种CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，(b)一种tracr配对序列，和(c)一种tracr序列其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者B)一种CRISPR酶系统，其中该系统由一种载体系统编码，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：(a)一个或多个指导序列，该一个或多个指导序列能够杂交到真核细胞中的一个或多个靶序列上，(b)一种tracr配对序列，和(c)一个或多个tracr序列，以及II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者C)一种多元CRISPR酶系统，其中该系统由一种载体系统编码，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含：(a)一个或多个指导序列，该一个或多个指导序列能够杂交到真核细胞中的一个或多个靶序列上，(b)一种tracr配对序列，和(c)一个或多个tracr序列，以及II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中在该多元系统中，使用多个chiRNA多核苷酸序列或者D)一种多元CRISPR酶系统，其中该系统由一种载体系统编码，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)能够杂交到细胞中的靶序列上的一个或多个指导序列，以及(b)至少一个或多个tracr配对序列，II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶编码序列，以及III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至一种tracr序列，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且其中在该多元系统中，使用多个指导序列以及单个tracr序列；并且其中，在A)的多核苷酸序列中，或在B)、C)或D)的系统中，该指导序列、tracr序列和tracr配对序列中的一种或多种被修饰以改进稳定性。