[发明专利]对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化

摘要

本发明提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物的工程化和优化。提供了涉及具体地包括Cas直向同源物酶的CRISPR复合物的组分的组合物以及方法。

主权项

(A)一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR‑Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，(b)一种tracr配对序列，和(c)一种tracr序列，以及II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，或者(B)一种非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含一种载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含：I.一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)一种指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和(b)至少一个或多个tracr配对序列，II.一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶编码序列，以及III.一种第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至一种tracr序列，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且其中在(A)或(B)中，该CRISPR酶是属于以下组的一个属的一种Cas9直向同源物，该组由以下各项组成：棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。