[发明专利]确定急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白变化的方法

摘要

本发明公开一种确定急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白变化的方法，其特点是：建立小鼠急性高血压模型;确定GSK3β/β-catenin信号通路参与急性高血压导致足细胞损害：应用Western blot、RQ-PCR测定上述蛋白及mRNA的表达;体外培养足细胞研究GSK3β/β-catenin信号通路对足细胞相关蛋白、细胞骨架蛋白的调控机制，进一步阐明GSK3β/β-catenin信号通路在急性高血压足细胞损害中的启动作用和核心作用。本发明应用“活体冷冻技术”结合冷冻置换方法进行了血液动力学改变时足细胞损伤的研究，为探索防止和减轻足细胞损伤，减少蛋白尿提供新的治疗靶点做出了贡献。

主权项

一种确定急性高血压肾损伤时足细胞骨架蛋白及其标志蛋白变化的方法，其特征在于有以下步骤：1.1、建立小鼠急性高血压模型,以活体麻醉状态下，结扎小鼠左侧肾动脉下的腹主动脉建立小鼠急性高血压模型，应用“活体冷冻技术”结合冷冻置换方法取材固定左肾组织;1.2、确定GSK3β/β‑catenin信号通路参与急性高血压导致足细胞损害：应用免疫组化方法及共聚焦显微镜，观察β‑catenin由细胞浆向细胞核内的转移，足细胞相关蛋白Nephrin、Cx43、Podocalyxin及细胞骨架蛋白α‑actin‑4、Synaptopoin分布关系，免疫电镜观察足细胞超微结构变化，应用Western blot、RQ‑PCR测定上述蛋白及mRNA的表达;1.3、体外培养足细胞研究GSK3β/β‑catenin信号通路对足细胞相关蛋白、细胞骨架蛋白的调控机制：体外培养足细胞，分别给予GSK3β、β‑catenin阻断剂及激动剂、PI3K、MAPK阻断剂及激动剂、AngII及ARB等以及模拟缺氧条件，应用放射免疫法、直接酶学方法或Western blot测定GSK3β、β‑catenin的活性，应用荧光染色共定位及Western blot观察β‑catenin、核转录因子TCF/LEF及靶基因Snail的分布及表达，；应用免疫组化染色及Western blot研究足细胞相关蛋白及骨架蛋白的分布及表达，应用流式细胞仪测定足细胞周期及细胞凋亡;1.4、活体内进一步阐明GSK3β/β‑catenin信号通路在急性高血压足细胞损害中的启动作用和核心作用：分别预先给予外源性的GSK3β阻断剂、β‑catenin阻断剂的急性高血压小鼠及GSK3β基因敲除、β‑catenin基因敲除小鼠，观察足细胞GSK3β和β‑catenin的活性，及信号通路下游关键蛋白的活性，测定足细胞相关蛋白和细胞骨架蛋白mRNA和蛋白表达；观察足细胞超微结构变化。