[发明专利]一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法

摘要

本发明公开了一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法，该方法的步骤如下：1）接种用器具准备；2）烟苗培育；3）接种菌丝体的准备；4）离体叶脉片的采集处理；5）在接种器具上放置离体叶脉片；6）接种病菌；7）接种后处置。本发明的优点是：1.接种发病过程时间短，占用空间场地少，方法简易便捷，工作效率高。2.本发明利用较大的烟叶，容易反映出结果病情的差异，烟叶的取材也较有保证；发病症状清晰易识别，重现性好，接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。

主权项

一种利用离体叶脉片接种烟草立枯病的人工发病方法，其特征在于，将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条（简称离体叶脉片），利用一套简单的器具接种烟草立枯病菌，导致离体叶脉片组织坏死而表现出清晰的发病症状；人工发病方法的步骤如下：1）接种用器具准备：接种用器具包括：大方盘、小方盘、玻璃罩、工作面板、支架板和支架片；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用；2）烟苗培育：按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用；3）接种菌丝体的准备：将立枯病菌移植到PSA普通真菌培养基平板中心，PSA培养基成分为：马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，水1000mL，28℃下培养至长出较大菌落，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作接种体；4）离体叶脉片的采集处理：用干净剪刀剪取步骤2）烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用；5）在接种器具上放置离体叶脉片：①组装接种用器具，方法是：取出步骤1）备好的器具，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，将工作面板垫靠在支架板和支架片架成的支架上，使面板形成稳定的倾斜状态；②放置离体叶脉片：取步骤4）备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳；然后往小方盘内注入清水，使水面浸没离体叶脉片的基部；6）接种病菌：挑取步骤3）准备的菌丝块，轻轻贴放于步骤5）操作完备的离体叶脉片上；7）接种后处置：步骤6）操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在26～28℃；接种结果导致叶脉片出现非常清楚的坏死病斑，一般接种后30小时开始出现坏死症状，4～6天后整个叶脉片全部坏死。