[发明专利]一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法

摘要

一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法。针对朱砂叶螨钠离子通道基因的kdr（knockdownresistance）突变进行PCR检测，通过引物设计、提取朱砂叶螨基因组DNA、PCR扩增等，可快速监测朱砂叶螨对拟除虫菊酯类杀虫、杀蟎剂的靶标抗性（kdr抗性）。本发明可节省大量生物试材、操作简单，结果快速、明确。可取代为掌握朱砂叶螨对拟除虫菊酯类杀虫、杀蟎剂抗药性发生、发展动态所采用的常规生物测定方法。

主权项

一种朱砂叶螨F1538I突变导致的kdr抗性的快速检测方法，其特征在于通过以下步骤实现：（1）使用等位基因PCR的方法，根据朱砂叶螨钠离子通道cDNA序列设计用于kdr突变基因型检测的特异引物：Primer1和Primer2用于扩增150bp左右非突变片段， Primer3和Primer4用于扩增600bp左右突变片段；Primer1  5'‑ TTCAAGTGGCAACATTCAAAGG‑3' Primer2  5'‑ AATAAACAGGTTAAGTGTGAA‑3'Primer3  5'‑ TTCATCATTTTTGGCTCTTTTA‑3'Primer4  5'‑ TGGTCAAGGGACATCACA‑3'（2）单头提取朱砂叶螨基因组DNA，PCR扩增，PCR体系为：10×PCR Buffer Reaction Buffer2.5μL、MgCl₂2.5μL、dNTP mixture2.0μL、S‑Forward0.5μL、S‑Reverse0.5μL、R‑Forward0.5μL、R‑ Reverse0.5μL、dd H₂O14.8μL、基因组DNA1.0μL、Taq DNA聚合酶0.2μL；PCR程序为：94℃预变性3min，94℃变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存；（3）PCR反应完成后，取10μL扩增产物进行1.0% 的琼脂糖凝胶电泳，经染色后，在凝胶成像系统上观察并拍照电泳结果；（4）结果鉴定，样品出现单一150bp带，无600bp带，则基因型为敏感纯合子；样品出现150bp和600bp两条带，则基因型为抗性杂合子；样品出现单一600bp带，无150bp带，则基因型为抗性纯合子；（5）根据朱砂叶螨基因型检测结果计算该种群的突变频率，将突变频率X带入公式Y=23435X+345.16进行计算，得到该种群的抗性水平Y值即LC₅₀值。