[发明专利]一种红叶石楠高效基因转化的方法

摘要

本发明涉及一种红叶石楠高效基因转化的方法，属于植物生物技术领域。具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括：(1)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；(8)共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern Blotting检测。本发明采用基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，所获得的转基因株系抗寒性得到了明显提高，导入的AmGS基因提高了转基因株系的抗寒性，从而为培育抗寒品种提供了重要依据。

主权项

一种红叶石楠高效基因转化的方法，其特征在于：具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括：(1)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；(8)共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern Blotting检测；上述各步骤具体如下：所述步骤(1)质粒DNA的提取：所用含有目的基因的农杆菌菌株LBA4404是含有35S启动子、目的基因、终止子NOS和标记基因NPTII的双元载体pCAMBIA2300—35S—OCS，在超净工作台上挑取保存的菌体接种YEP固体培养基的培养，菌板置于恒温培养箱，28℃培养2～3d，至单菌落产生；挑取单菌落接种YEP液体培养基的培养，在恒温摇床上28℃、200～210r／min过夜培养(24h左右至对数生长后期)，待OD600值为0.5～0.8时可用于质粒DNA的提取；从在含20mg／l Kanamycin和15mg／lGentamycin5—8ml的液体YEP培养基中接Agrobacterium细胞，然后在28℃、200—220rpm培养24h；然后进行质粒提取；新鲜配制SolII溶液(880μl H20，100μlSDS10％，20μl10N NaOH)，及包含4mg／ml溶菌酶Lysozyme的200μl SolI(P1)溶液；对培养一昼夜的的Falcon试管在3600rpm速度下进行离心12min，丢弃上清；用200μl5M NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀，转移到Eppendorf管中；加入20μl10％N—Lauroylsarcosine sodium溶液，上下倒置6—8次混匀(从不同方向倒置)；最大速度(13000rpm)下离心2min，丢掉上清液；用200μl含4mg／ml Lysozyme的Sol I(P1)(Sol I：50mM glucose，25mM Tris—Cl(8.0)，10M EDTA(8.0))重悬沉淀，涡旋直至混匀，置于冰上，加入400μl Sol II(P2)(Sol II：880μlH2O，100μl SDS10％，20μl10N NaOH)，上下倒置6‑8次混匀(从不同方向倒置)，在冰上放置5min，加入300μl Sol III(P3)，用手振荡；在冰上放置10min；SolIII=Buffer P3，Neutrilization solution.最大速度(12000rpm)下离心12min，将上清液(700μl)转移到新的Eppendorf管中，用1×酚／氯仿(Phenol／Chloroforum：350μl Phenol+350μlChlororum，“Choloforum”：24倍体积chloroforum与1倍体积i soamylalcohol)抽提；在通风橱中，往Eppendorf管中加入酚和氯仿；涡旋15s，12000rpm下离心2min；将上层相(700μl)小心移入新的Eppendorf管中；倾斜吸取，防止吸入下层的酚／氯仿；用700μlisopropanel沉淀，室温下放置5min；12000rpmg下离心15min，小心除去上清；先用大移液管移走大部分上清，剩余50μl左右再离心5min；用70％酒精洗涤；加入1ml70％酒精，12000rpm下离心5min，小心移去上清；室温下晾干；20μlTE+10mg／ml RNase A重悬沉淀；在冷室放置一昼夜，后贮于‑20℃冰箱；将DNA提取液稀释100倍，用UV‑2450紫外可见分光光度计测定其在波长260nm和280nm波长下的吸收值，OD260／OD280=1.8～1.9为高纯度DNA，大于1.9则有RNA污染，小于1.8说明有蛋白质污染；DNA浓度按以下公式计算：DNA浓度(ng／μL)=OD260×50×稀释倍数；将质粒DNA用0.1％TE溶液稀释为200μg／mL、500μg／mL、800μg／mL三种浓度，分装好贮藏在‑20℃冰箱中备用；所述步骤(2)受体材料的准备：红叶石楠茎段长度为1‑1.5em，经0.4mol／L渗透压培养基(MS培养基添加0.2mol／L甘露醇，0.2mol／L山梨醇)处理4—6h做基因枪轰击之用；所述步骤(3)钨粉预处理：取60mg直径为1μm的钨粉，加入1ml无水乙醇，95℃温育1h，在最大功率下超声处理3次，每次5min(，离心除去上清；加1ml无水乙醇，旋涡震荡3—5min，离心除去上清；加1ml无菌水，旋涡震荡，离心，弃上清，重复3次；用含50％甘油的无菌水悬浮，使其浓度为60mg／ml；所述步骤(4)微弹制备：取步骤(3)悬浮液50μl，加入6μl质粒DNA(1μg／μl)，20μl亚精胺(0.1M)，50μlCaCl2(2.5M)；震荡1min，静置1min，离心，弃上清；加70％乙醇至600μl，200W功率下超声处理4—6次，每次1秒，离心，弃上清；加150μl无水乙醇，不破坏沉淀，静置1min，弃上清；加入60μl无水乙醇，震荡，每次轰击量5—10μl；所述步骤(5)基因枪轰击：基因枪为Bio—Rad PDS1000／He型，取金粉悬液(60mg，直径1.5—3.0μm的金粉，用无水乙醇消毒，悬浮于1ml无菌水中)25μl，加入5μgAmGS质粒DNA，50μl2.5mol/LCacl2，20μl0.1mol／L亚精胺，充分混匀，离心，无水乙醇沉淀，重新悬于60μl无水乙醇，备用；可裂膜选用1550psi，将可裂膜、载体膜事先用70％乙醇浸泡半小时，在超净工作台晾干；每次吸取10μlDNA‑金粉复合体涂布于载体膜，充分晾干；选取生长状态旺盛、大小一致的愈伤组织进行轰击，靶材料距离可裂膜5‑10cm，每皿受体材料轰击1次；轰击后的愈伤组织及时转到MS固体培养基上恢复生长4—7天，进行筛选，选取生长状态好的茎段进行农杆菌侵染转化；所述步骤(6)受体材料的预培养：选取步骤(3)中恢复筛选后的茎段，长度为1‑1.5cm，保留至少一个芽，将茎段浅嵌于分化培养基表面；培养基厚度1‑2cm，每瓶培养基体积约15—20ml，每瓶培养基可放6—8个茎段；将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2—6d，培养温度25℃左右；所述步骤(7)中农杆菌侵染：先将制备好的农杆菌LBA4404菌液和MS母液按1／3—1／2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.2‑6.7；再将预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，之后于无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理；刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15—20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触；所述步骤(8)共培养：将侵染后的受体茎段，用无菌滤纸吸干表面液体，转于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6—8个茎段放置；将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2—4d；所述步骤(9)中抑菌及卡那霉素筛选培养：将受体材料转接于含有Kanamycin(卡那霉素)和抑菌素Cefradine(头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行(pH6.2—7.0)；第一阶段Kan10‑15mg／L，Cef350—400mg／L，培养5—8d；第二阶段Kan40—45mg／L，Cef300—350mg／L，培养14—21d；第三阶段卡Kan45—50mg／L，Cef150—200mg／L，培养20—30d；所述步骤(10)中转化植株PCR和Southern Blotting检测：经抑菌和筛选培养，受体茎段表现出明显分离生长状态，超过1／4的茎段出现由黄花至枯死或者的变化，约3／4茎段萌发出绿色的抗性新芽，CTAB法提取基因组DNA并进行PCR扩增检测；目的基因引物序列如下：AmGS—F：TCA TGG CAC CTG ATA TCA CCA CCG CT；AmGS—R：TAT TAG GCA GCG GAT GGG GCG GGA A；反应体系：ddH2O(38.5μL)；Buffer(6μL)；dNTP(2μL)；Primerl(1μL)；Primer2(1μL)；Template DNA(1μL)；TaqE(0.5μL)；Total(50μL)；扩增程序：反应程序：预变性，94℃，5min；变性，94℃，30sec；复性，55℃，40sec；扩增，72℃，1Min，30cycle；延伸，72℃，10Min；对PCR检测结果阳性的转基因植株和未转基因的对照植株采用PCR标记法进行Southern检测；具体方法为：用NotI和SacI双酶切pATCAmGS质粒DNA，DIG—dUTP标记(地高辛杂交检测试剂盒)，得到800bp的片段为标记探针；预杂交：取10.0mlHyb高效杂交液(Hyb‑100)，加入杂交管中，60℃杂交炉中预杂交2h；探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10分钟，立即放冰水浴冷却5min；杂交：排尽预杂交液，在10.0mlHyb高效杂交液(Hyb‑100)加入4.0μl新变性好的探针，混匀，60℃杂交仪中杂交过夜；洗膜、信号检测。